[发明专利]一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用。

背景技术

腈是一类重要的前体化合物，经水合反应合成酰胺及其衍生物，在化学合成中处于及其重要的地位。传统氰基的水合反应需要强酸、强碱和高温等苛刻的反应条件，势必产生大量废液，对环境造成了严重的污染。

与传统化学水解法比较，生物转化法具有条件温和、反应高效、环境友好，且能实现化学、区域和对映体选择性等优点。腈水合酶(Nitrile hydratase,EC 4.2.1.84)催化腈类化合物(-CN)生成相应的酰胺(CONH₂)，被应用于化学品的工业催化生产中，对传统化学合成工艺的绿色化学改造有着重要的意义。

在自然界中，生产腈水合酶的微生物分布非常广泛，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中，一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺等化合物的工业化生产中，如专利号为US007405064B2的专利文献公开了一种野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D；专利号ZL88106735的专利文献公开了一种野生玫瑰色红球菌J1；专利号为ZL86100062的专利文献公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为ZL99106291.4的专利文献公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095。

采用野生微生物是生产丙烯酰胺、烟酰胺的重要方法。然而，野生菌株的腈水合酶存在活力稳定性较差，对底物和产物的耐受性不高，产品质量不够稳定等问题。而且，在腈水合酶的基因簇中往往同时含有酰胺酶基因，从而可以转化丙烯酰胺和烟酰胺为丙烯酸和烟酸，严重影响到目标产物的纯度和实际产率，增加酰胺分离纯化的难度和生产成本。

随着生物技术的迅速发展，采用基因工程手段构建表达外源腈水合酶的基因工程菌株，不仅可以提高腈水合酶在细胞内的表达量，从源头上阻断酰胺的进一步水解，保证酰胺产品的高质量。锰氧化细菌在海洋锰循环中起着举足轻重的作用，目前的研究和应用主要集中于促进高锰污水处理方面，而对锰氧化细菌中腈水解酶类的发现和应用还未见报道。

另一方面，在生物催化反应中，温度是一个非常关键的因素。这不仅影响催化剂的活力和稳定性，而且还直接决定了反应液中各种物质的溶解度、反应速率，以及反应介质的粘度等。因此，提高催化剂酶蛋白的热稳定性显得尤为重要。目前，除了上述已经工业化应用的三种腈水合酶，已报道的大部分腈水合酶都表现出了热不稳定性。如30℃条件下，来源于Rhodococcus sp.R312和P.chlororaphis B23(Prasad S.Bhalla T.C.Nitrile hydratases(NHases):At the interface of academia and industry[J].Biotechnol.Adv.2010,28:725-741.)的腈水合酶保持10min则完全失活。热稳定差也是限制腈水合酶大规模应用的因素之一。

发明内容

本发明提供了一种腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用，该腈水合酶具有活力高、底物谱广、热稳定性好和适合工业化应用的特点。

本发明提供了一种耐热腈水合酶，包括：碱基序列如SEQ ID NO.4所示的编码α亚基的基因、碱基序列如SEQ ID NO.5所示的编码β亚基的基因以及碱基序列如SEQ ID NO.6所示的编码活化元件的基因。

上述耐热腈水合酶属于多亚基酶蛋白，其中的α亚基、β亚基和活化元件均克隆自锰氧化橙单锰胞菌(Aurantimonas manganoxydans)SI859A。α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

所述的活化元件存在于锰氧化橙单锰胞菌的腈水合酶基因簇中。该活性元件基因表达后是一种激活蛋白，该激活蛋白质能够在腈水合酶的表达和组装过程中发挥作用，确保腈水合酶的正确表达，从而获得高活力的腈水合酶。本发明活化元件表达的激活蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

进一步地，所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。