[发明专利]一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽

说明书

技术领域

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体是一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽。

背景技术

厚壳贻贝（Mylius coruscus）又称海红，是贻贝目壳菜蛤属中的一种，主要分布于黄、渤海和东海沿岸，浙江省自然资源丰富，尤其在舟山（舟山嵊泗有“贻贝之乡”之称）。

高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。由于脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常称为高脂血症，脂质不溶或微溶于水必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，因此，高脂血症常为高脂蛋白血症（hyperlipoproteinemia），表现为高胆固醇血症、高甘油三酯血症等。高脂血症在中老年人群中发病率高，而且和其他疾病如高血压，糖尿病及动脉粥样硬化的成因关系紧密，对血脂的调节，有助于治疗心血管系统疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys，体外活性显示具有较好的调节脂质代谢的活性。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys（DQLTK）。上述调脂五肽通过影响小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性，抑制食物和胆固醇在小肠刷状缘的吸收，减少肠道胆固醇向肝脏转运，从而减少肝脏细胞胆固醇的含量。但调脂五肽对小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性的具体影响机理尚不明确。经检测，上述调脂五肽可明显降低细胞中总胆固醇（TC）含量和甘油三脂（TG）含量。

调脂五肽以厚壳贻贝粉末为原料，通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解，乙醇醇沉，再经Sephadex G-15凝胶色谱柱层析纯化和高效液相色谱分离纯化得到。

厚壳贻贝粉末与蒸馏水的质量体积比为1g：15~25mL，两者充分搅拌得到酶解底物；搅拌过程中温度条件为50~70℃恒温，搅拌时间为1.5~2.5h；酶解结束后均采用沸水浴灭酶。充分搅拌使得厚壳贻贝粉末均匀分布在蒸馏水中，形成的酶解底物适合木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的分步酶解。

木瓜蛋白酶的加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.3~0.5倍，酶解pH为6.5~7.5，酶解时间为2.0~3.5h；胰蛋白酶加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.07~0.15倍，酶解pH为9.5~10.5，酶解时间为2.0~4.0h；胰蛋白酶酶解结束后溶液pH调至中性，酶解液浓缩至原体积的1/25~1/15。采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解方式将厚壳贻贝粉末中的蛋白质酶解成分子量小的活性物质。木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件不同，采用分步酶解的方式使得两种蛋白酶的酶解效率均处于较高状态。

乙醇醇沉操作为在酶解浓缩液中加入3~6倍体积的85~95%乙醇，搅拌后静置，离心取沉淀，得到的沉淀即为调脂五肽粗品。调脂五肽属于活性短肽，不溶于乙醇，采用乙醇醇沉的方式将调脂五肽从混合溶液中分离出来，对产品进行初步纯化。醇沉得到的调脂五肽空间结构未受破坏，仍具有较好的生物活性。

Sephadex G-15凝胶色谱柱层析纯化操作为：用蒸馏水将Sephadex G-15凝胶溶胀后装柱，检查柱均匀性后上样，用自动取样器收集洗脱液，在280nm下测紫外吸光度，做曲线；重复上样，根据吸光度曲线收集分离的溶液；上样溶液由质量体积比为1g：3~7mL的调脂五肽粗品和蒸馏水混合而成。先采用Sephadex G-15凝胶色谱柱层析纯化调脂五肽粗品，减少后续高效液相色谱分离纯化的时间成本、原料成本和人工成本。

高效液相色谱分离纯化条件为：色谱柱：反相C18键合硅胶柱；流动相：0~4min，水；4~16min，60~80%水，20~40%乙腈；16~35min，乙腈；流速：0.7~1.3ml/min，柱温25~35℃，检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到调脂五肽纯品。

厚壳贻贝粉末为厚壳贻贝闭壳肌脱脂干燥得到。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的一种厚壳贻贝闭壳肌酶解调脂五肽，氨基酸序列为Asp-Gln-Leu-Thr-Lys（DQLTK）。上述调脂五肽通过影响小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性，抑制食物和胆固醇在小肠刷状缘的吸收，减少肠道胆固醇向肝脏转运，从而减少肝脏细胞胆固醇的含量。但调脂五肽对小肠刷状缘摄取和转运胆固醇微胶粒的载体活性的具体影响机理尚不明确。经检测，上述调脂五肽可明显降低细胞中总胆固醇（TC）含量和甘油三脂（TG）含量。