[发明专利]RT-qPCR检测猕猴ABCG2基因转录水平的方法

说明书

本发明提供一种RT‑qPCR检测猕猴ABCG2基因转录水平的方法，以猕猴新鲜肾脏组织提取的总RNA逆转录合成得到的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，获得ABCG2基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰、扩增效率，通过常规处理得均一化后的ABCG2基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得ABCG2基因转录水平相对表达值。为研究猕猴ABCG2功能以及相关药物对其影响提供了有效途径。本发明适用于实时定量PCR检测，其操作简单，可重复性高，检测成本低、灵敏性高、特异性强。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白ABCG2基因转录水平的方法，属于分子生物技术领域。

背景技术

近年来，全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)已检出多个导致高尿酸血症和痛风的易感位点及相关候选基因。其中SLC2A9、SLC22A11和SLC22A12基因功能缺失性突变可引起遗传性低尿酸血症，而过表达则会加强尿酸的重吸收。ABCG2、SLC17A1和SLC17A3基因功能缺陷型变异会降低肾脏和肠道对尿酸的排泄量。ABCG2作为一种转运蛋白，定位于细胞膜，广泛分布在具有分泌及排泄功能的组织中，肾脏中的ABCG2位于肾近端小管上皮细胞膜刷状缘，介导细胞内尿酸分泌，是一种高能的尿酸转运蛋白。研究发现ABCG2的常见单核苷酸多态性rs2231142与尿酸水平和痛风显著相关，其突变使肠道和肾脏尿酸排泄受阻而导致高尿酸血症和痛风。ABCG2单核苷酸基因多态性分析研究及日本人群受试者数量性状遗传位点分析显示，该功能缺失能够阻碍尿酸排泄使血清尿酸浓度上升，引发高尿酸血症。以上研究证明ABCG2与尿酸排泄紧密相关。

近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构和生活习惯发生了改变，高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病学研究资料表明高尿酸血症和原发性痛风的发病呈上升趋势，在中国，已经有1.2亿的HUA人群，大约占总人口的10%，中老年及绝经后的妇女为高发人群，近年来发病年龄也呈年轻化的趋势。高尿酸血症与肥胖、高血压、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志，治疗和控制高尿酸血症已成为代谢性疾病治疗的重要组成部分。无论是药物的筛选, 还是致病机制的研究, 都需要选择一种科学、合理的动物模型来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物。

猕猴(Macaca Malatta)，又名恒河猴（rhesus monkey），由于在形态学、生理生化代谢等方面与人类非常相似，是较为理想的实验动物，常用于许多重要的科学研究。其尿酸代谢途径与人类相似，是研究该病的最佳实验动物，为了利用亲缘关系与人类接近的实验动物—猕猴来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物，需要建立一种猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白ABCG2 mRNA 表达的相对定量方法，以研究药物作用猕猴体内ABCG2 mRNA基因的转录水平变化，进而为研究ABCG2功能及其对机体血清尿酸的影响因素打下基础。因此, 建立RT-qPCR检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白- ABCG2 mRNA基因转录水平的方法，可对于开展利用动物模型开展的HUA发病机制研究及新药筛选具有重要意义。