[发明专利]RT-qPCR检测猕猴ABCG2基因转录水平的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的RT-qPCR检测猕猴ABCG2基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)设计下列引物：

猕猴ABCG2基因表达水平的特异性上、下游引物为：

ABCG2 F：5’-TTAGCTGCAAGGAAAGATCCAAG-3’

ABCG2 R：5’-GTCATAGTTGTTGGAAGCCGAAG-3’

作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：

GAPDH F：5’-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇

GAPDH R：5’-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇；

(2)以猕猴新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得猕猴肾脏组织cDNA第一链；

(3)以步骤(2)的猕猴肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤(1)中的ABCG2 F和ABCG2 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得ABCG2基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及熔解峰；

所述PCR扩增体系及反应条件如下：

PCR扩增体系即25μL体系：

SYBR Premix Ex Taq II酶12.5μL，cDNA模板1μL，ABCG2 F和ABCG2 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；

SYBR Premix Ex Taq II酶12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；

反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；

(4)将步骤(2)的猕猴肾脏组织cDNA第一链稀释为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤(1)中的ABCG2 F和ABCG2 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别按步骤(3)的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager软件建立ABCG2基因及内参基因GAPDH的标准曲线，得到ABCG2基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R²值；

(5)在步骤(3)的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤(2)的猕猴肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤(4)得到的ABCG2基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFX Manager软件处理，得出均一化后的ABCG2基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得ABCG2基因转录水平相对表达值。

2.如权利要求1所述的非疾病诊断目的的RT-qPCR检测猕猴ABCG2基因转录水平的方法，其特征在于所述步骤(3)获得的PCR扩增产物ABCG2基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：

1)通过商业生物公司测序分别得到：

所扩增的猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白ABCG2基因片段核苷酸序列为：

GTATTTTAGGATTTCTGAAGTTCTGATAATGGAGCACTGCGACCTACCAATTTCAAATGTAATTCAGGTTACGTGGTACAAGATGATGTCGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTCCAACAACTATGAC

所扩增的猕猴内参基因GAPDH片段核苷酸序列为：

GGCGCGCCTTTGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTTCACCACCACGGAGAAGGCTGGGGCTCATTA

2)再将上述测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的猕猴的ABCG2基因及猕猴GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的猕猴肾脏组织ABCG2基因与NCBI报道的序列登录号为NM_001032919.1的猕猴ABCG2基因的同源性为90.91％；用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的猕猴肾脏组织中GAPDH与NCBI报道的序列登录号为NM_001195426.1的猕猴GAPDH基因的同源性为91.14％，证明本发明所扩增出的目的片段分别为：猕猴ABCG2基因片段及GAPDH基因片段。