[发明专利]一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，具体涉及一种将低分子肝素经亚硝酸降解后，通过多孔石墨化碳色谱与高分辨率质谱联用分析低分子肝素二糖组成单元的方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。

背景技术

肝素是糖胺聚糖家族中的一类，被应用于临床抗血栓治疗。但长期以来，肝素类药物在临床治疗过程中一直存在一定的治疗风险。而肝素经物理方法、化学方法或者酶法降解制备而成的低分子肝素不仅具有肝素的抗血栓特点，并且降低了出血的风险，从而被广泛应用，这也使得对低分子肝素进行结构表征变得更加迫切。

由于低分子肝素结构组成的不均一性，硫酸化、乙酰化程度的不稳定性、糖醛酸差向异构等的复杂性，对其进行结构表征有较大难度。对低分子肝素二糖组成单元进行分析是对其结构表征的重要方面，通常分析低分子肝素二糖单元的方法有：将肝素经肝素酶完全降解后采用亲水相互作用色谱法，具体参见Li G,et al.Journal of Analytical Chemistry,2014,86(13):6626-6632。但低分子肝素经肝素酶完全降解后会破坏糖醛酸差向异构等信息，且以上常用的色谱法均无法分离肝素二糖组成单元中糖醛酸的同分异构体。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，通过亚硝酸降解低分子肝素后采用多孔石墨化碳色谱法，对低分子肝素二糖结构中糖醛酸的同分异构体有极高的分辨能力，从而对其进行定性分析。

发明概述

本发明将低分子肝素经亚硝酸降解后，进行多孔石墨化碳色谱与高分辨率质谱联用分析肝素二糖组成单元中糖醛酸的同分异构体。通过亚硝酸将低分子肝素降解成二糖单元，并通过多孔石墨化碳色谱法分离各同分异构体，再通过高分辨率质谱获取精确分子量，从而对低分子肝素完全降解的二糖单元进行分析。

发明详述

一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，包括步骤如下：

(1)配制肼解溶液：配制硫酸肼浓度为0.5-2％(w/w)、肼浓度为40-80％(v/v)的肼解溶液；

(2)称量一定量的低分子肝素样品，将其溶解在步骤(1)配制的肼解溶液中，低分子肝素的浓度为0.5～1mg/mL；在90-98℃下加热3-5h后，停止加热并冷却到0℃以下；在20-40℃下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，获取转干的肼解过的低分子肝素样品；

(3)配制pH值为1.5-2的HNO₂试剂；

(4)将步骤(2)获取的低分子肝素样品溶解于步骤(3)获取的HNO₂试剂中，低分子肝素样品的浓度为0.5～1mg/mL，冰浴振荡15～20min后，将pH值调至3.5-4.5；

(5)配制pH值为3.5-4.5的HNO₂试剂；

(6)加入与步骤(4)最终获取的溶液等体积的步骤(5)配制的HNO₂试剂于步骤(4)最终获取的溶液中，冰浴振荡30～40min后，将pH值调至8-10；

(7)加入与步骤(2)中称量的低分子肝素样品1-2倍质量的硼氢化物溶液于步骤(6)最终获取的溶液中；25-50℃下还原8～12h；

(8)将步骤(7)最终获取的溶液的pH值调至3-5后，反应15～20min后，再将溶液的pH调至中性，获得HNO₂降解后的低分子肝素样品；

(9)采用G-10色谱法进行一次脱盐，一次脱盐完成后进入步骤(10)或步骤(11)；

(10)通过GPC色谱法进行二次脱盐，二次脱盐完成后进入步骤(12)；

(11)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(9)脱盐后的经过HNO₂降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；

配制流动相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5-6；

配制流动相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水调pH至5-6；

用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100-200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

0～30min，100％流动相A；30-34min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；34～90min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～115min，100％流动相A；进入步骤(13)；