[发明专利]一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法

权利要求书

1.一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)配制肼解溶液：配制硫酸肼浓度为0.5-2％(w/w)、肼浓度为40-80％(v/v)的肼解溶液；

(2)称量一定量的低分子肝素样品，将其溶解在步骤(1)配制的肼解溶液中，低分子肝素的浓度为0.5～1mg/mL；在90-98℃下加热3-5h后，停止加热并冷却到0℃以下；在20-40℃下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，获取转干的肼解过的低分子肝素样品；

(3)配制pH值为1.5-2的HNO₂试剂；

(4)将步骤(2)获取的低分子肝素样品溶解于步骤(3)获取的HNO₂试剂中，低分子肝素样品的浓度为0.5～1mg/mL，冰浴振荡15～20min后，将pH值调至3.5-4.5；

(5)配制pH值为3.5-4.5的HNO₂试剂；

(6)加入与步骤(4)最终获取的溶液等体积的步骤(5)配制的HNO₂试剂于步骤(4)最终获取的溶液中，冰浴振荡30～40min后，将pH值调至8-10；

(7)加入与步骤(2)中称量的低分子肝素样品1-2倍质量的硼氢化物溶液于步骤(6)最终获取的溶液中；25-50℃下还原8～12h；

(8)将步骤(7)最终获取的溶液的pH值调至3-5后，反应15～20min后，再将溶液的pH调至中性，获得HNO₂降解后的低分子肝素样品；

(9)采用G-10色谱法进行一次脱盐，一次脱盐完成后进入步骤(10)或步骤(11)；

(10)通过GPC色谱法进行二次脱盐，二次脱盐完成后进入步骤(12)；

(11)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(9)脱盐后的经过HNO₂降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；

配制流动相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5-6；

配制流动相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水调pH至5-6；

用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100-200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

0～30min，100％流动相A；30-34min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；34～90min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～115min，100％流动相A；进入步骤(13)；

(12)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(10)脱盐后的经过HNO₂降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；

配制流动相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5-6；

配制流动相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水调pH至5-6；

用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100-200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：

0～4min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；4～60min，83-87％流动相A，13-17％流动相B；60～70min，100％流动相B；70～85min，100％流动相A；进入步骤(13)；

(13)在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

(14)根据步骤(13)中获得的高分辨质谱图，并按照不同结构形式的质荷比，得到提取离子流图；

(15)通过质荷比的数值确定组分分子式，解析该组分的质谱MS/MS信息对不同组分的硫酸基团进行位置归属，确定各峰结构。

2.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(1)，配制肼解溶液，包括步骤如下：将硫酸肼溶解于去离子水中，再加入无水肼，配制硫酸肼浓度为1％(w/w)，肼浓度为60％(v/v)的肼解溶液。

3.根据权利要求1所述的一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，所述步骤(2)，在室温下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，包括步骤如下：通风橱中通过空气流使肼蒸发后，反复蒸发转干，彻底除去残留肼。