[发明专利]一种快速测定IL‑6/IL‑6受体抗体药物生物学活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物药物活性检测领域，针对IL-6/IL-6R单克隆抗体药物生物学活性测定建立了更加快速、准确的定量检测方法。

背景技术

单克隆抗体已经成为全球医药市场的重要组成部分，并贡献了主要的市场扩容力量，2016年全球畅销药排名前十的重磅药中以阿达木单抗为首的单克隆抗体药物占据半壁江山。面对抗体类药物的快速发展，迫切需要建立相应的抗体药物质量评价技术体系，而活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。目前活性检测方法多采用基于细胞的生物活性测定方法，包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、补体依赖的细胞毒法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法和细胞ELISA法。

托珠单抗(Tocilizumab，商品名雅美罗)是一种IL-6受体阻断剂，于2010年1月8日获FDA批准上市，用于治疗对抗风湿药物(DMARDs)应答不足的中度至重度活动性类风湿关节炎的成年患者。托珠单抗与膜型或者可溶性IL-6受体结合，阻断其与IL-6的结合，使IL-6信号通路不能被激活，从而抑制多种免疫反应相关的机制，包括B细胞的活化和T细胞分化成炎性细胞等，可以有效改善类风湿性关节炎的症状。

目前托珠单抗的生物学活性测定方法主要是细胞增殖抑制的方法，该方法依据对IL-6有生长依赖性的人白血病细胞系KT-3/DS-1，加入托珠单抗和IL-6，两者竞争性结合细胞表面IL-6受体，孵育72小时后，通过测定细胞的数量来定量托珠单抗的细胞增殖抑制作用。该方法实验周期长(托珠单抗作用时间72小时，加入底物后孵育时间3小时)，变异较大。

本发明采用转基因细胞测活方法，实验当天即可获得结果，实验周期短，操作简便，并且避免了长时间孵育所带来的细胞污染可能性等客观因素的问题。

发明内容

本发明提供了一种快速测定IL-6/IL-6R抗体药物生物学活性的方法，所述方法包括构建得到稳定表达SIE报告基因的效应细胞，用IL-6刺激激活报告基因表达，并用IL-6/IL-6R抗体药物阻断IL-6信号通路，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。

本发明的目的在于提供一种快速测定IL-6/IL-6R抗体药物生物学活性的方法，所述方法包括：

(1)构建得到稳定表达SIE报告基因的效应细胞；

(2)将IL-6加至(1)所述细胞中刺激激活报告基因表达；

(3)将IL-6/IL-6R抗体药物样品及参比品等比例稀释，将稀释后的抗体分别转移至步骤(2)中的细胞和IL-6混合物中，在37℃培养箱中进行孵育；

(4)加入荧光素酶底物，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。

DS-1细胞属于IL-6依赖小鼠B淋巴细胞，其表面表达有IL-6受体(由配体结合链α链和信号转导链gp130组成)，IL-6与IL-6R结合，活化与gp130偶联的JAK蛋白并激活STAT3，STAT3蛋白形成二聚体，进入细胞核识别并结合GAS或者SIE序列，从而维持DS1细胞的存活和增殖。将SIE-luciferase序列导入DS-1细胞内，IL-6与IL-6R结合后激活JAK-STAT信号通路，并启动与SIE序列连接的荧光素酶报告基因的表达。抗IL-6R抗体与IL-6竞争性结合IL-6受体，阻断IL-6信号通路，因此抗IL-6R抗体浓度与效应细胞中的荧光素酶表达量成反比。

在本发明的实施方案中，稳定表达SIE报告基因的效应细胞选自DS-1细胞、MH60.BSF2细胞、B9细胞293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、549A细胞、3T3细胞中的任一种，优选为稳定表达SIE报告基因的DS-1细胞。

在本发明的实施方案中，报告基因为luciferase荧光素酶报告基因。

在本发明的实施方案中，所述步骤(1)包括：用包含SIE序列的报告基因载体转染DS-1细胞、MH60.BSF2细胞、B9细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、549A细胞或3T3细胞，并加入相应抗生素筛选得到稳定表达报告基因的单克隆细胞株。