[发明专利]一种卵巢癌AnnexinA3检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤检测领域，特别涉及一种卵巢癌Annexin A3检测试剂盒。

背景技术

卵巢癌是死亡率居首位的女性生殖系统恶性肿瘤，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是临床治疗的主要障碍。运用钴类耐药标记蛋白，早期发现肿瘤耐药，有助于临床及时调整化疗方案，改善患者预后。

卵巢癌患者对铂类药物药的临床评价标准包括：化疗期肿瘤进展、停化疗个月内肿瘤复发以及对一线化疗的最好反应为可测量肿瘤无变化。这一标准的最大特点是直到化疗进行到一定阶段或肿瘤复发后，才能判断出患者对于化疗药物的敏感性，从而使这部分患者在接受一线化疗期间就进入耐药。多年来，致力于临床肿瘤治疗学的研究者们一直期盼能在患者接受化疗之前或治疗初期预知肿瘤的耐药性，以便及时调整化疗方案，达到提高肿瘤缓解率、改善患者预后的目的，发现一种铂类耐药标记蛋白是解决这一问题的关键途径。

由于Annexin A3定位于细胞浆和胞核，不存在信号肽和跨膜区域，其能否成为铂类耐药相关的标记蛋白取决于其能否被分泌到细胞外。而现有技术中，当样品量较少的情况下，主要是采用ELISA方法来检测Annexin A3蛋白在外周血中的表达的。但当样本量较大的情况下，Annexin A3ELISA定量检测试剂盒虽然实现了高通量检测，但在经过严格的质控后，该试剂盒表现出敏感性欠佳、重复性差的突出问题，造成实验数据的不稳定。研制一种能高通量、稳定检测人外周血表达水平的免疫分析试剂盒成为亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵巢癌Annexin A3检测试剂盒，该检测试剂盒精密性高。

本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：一种卵巢癌Annexin A3检测试剂盒，包括包被有Annexin A3捕获抗体的孔板、Annexin A3标准品S0～S5、浓度分别为1.6ng/mL和0.8ng/mL的质控品、辣根过氧化物酶标记的检测抗体、化学发光底物液A、化学发光底物液B、浓缩洗漆液。

通过采用上述技术方案，不管样品量是否较大，该种卵巢癌Annexin A3检测试剂盒都能够保证较高的灵敏性和准确度。

优选为，所述辣根过氧化物酶标记的检测抗体的由以下步骤制得：a.HRP5mg溶于1.2mL0.2mol/L pH5.6醋酸盐缓冲液中，加入0.1mol/LNaIO₄溶液0.5mL，2～8℃搅拌反应1小时；

b.加入0.8mol/L乙二醇0.2mL，2～8℃搅拌反应30分钟；

c.将酶液装入透析袋中，用0.001mol/L Ph4.2醋酸盐缓冲液透析过夜；

d.取Annexin A3检测抗体1mg，用pH9.5 1.0mol/L碳酸盐缓冲液调pH至9.0～9.5，2～8℃搅拌反应3小时；

e.加入NaH₄B溶液使终浓度为1mg/mL，2～8℃搅拌反应1小时，Ph7.4 0.02mol/L磷酸盐缓冲液透析过夜；

f.加等体积甘油，混匀后-20℃保存；

用酶标检测抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的检测抗体稀释为1∶250。

优选为，所述辣根过氧化物酶内加有含pH＝7.4HEPES缓冲液50mM，BSA 2.1～2.4g/L，MgSO₄ 11～13mM，NaCl1.2～1.8mM，ZnSO₄0.6～0.9mM，β-环糊精0.6～1.2g/L，海藻糖1.2～1.8g/L，甘油1.0～1.4g/L，十二烷基二甲基甜菜碱1.2～1.8g/L，防腐剂Proclin300 1.1～1.5g/L的稳定剂。

通过采用上述技术方案，稳定剂能够长期保持酶的活性及辣根过氧化物酶偶联物的空间构象，并且稳定性好，可显著改善测试试剂盒的货架寿命，提高其商业价值。

优选为，所述辣根过氧化物酶与稳定剂的重量比为1∶3～5。

通过采用上述技术方案，当稳定剂和辣根过氧化物酶的重量比值在4左右的时候，辣根过氧化物酶的保持就已经趋于最长，之后即使比值近一步增大，辣根过氧化物酶的保存时间也基本不会有较大的改变。所以，将稳定剂和辣根过氧化物酶的重量比值取至1∶3～5，这样能够减少稳定剂的用量，又能够尽可能地延长辣根过氧化物酶的保存时间。

优选为，所述酶标检测抗体稀释液由200mL小牛血清加800mL 0.02mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液加1mL Proclin300，混匀后制成。