[发明专利]3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。其中，该引物探针组合物包括：检测EGFR基因19～21号外显子特定突变的引物及探针，突变为EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR 2235_2249del15和EGFR 2236_2250del15。应用本发明的3D‑PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物，包含了与肺癌相关的4个常见突变位点，根据不同突变位点设计的引物及探针分别对各突变位点进行检测，不仅能检测多种突变，检测效率高，而且将其结合3D‑PCR的检测方法进行检测，使得结果更加直观清晰。

技术领域

本发明涉及3D-PCR检测领域，具体而言，涉及一种3D数字PCR检测EGFR特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。

背景技术

国际癌症研究中心(IARC)预计，癌症发病人数将会以每年3％～5％的速度递增，并有调查研究显示中低收入国家癌症的发病率远高于发达国家，预计在2020年全球将有2000万新发病例的产生，死亡病例将达1200万。所以各国对癌症采取的预防措施刻不容缓。每年我国用于癌症病人的医疗支出高达800亿元，约占卫生总支出的20％，远高于其他慢性病的医疗费用。近些年来，我国癌症的发病率逐年提高，尤其是肺癌发病率逐年上升。研究显示，肺癌发病率居癌症发病率首位，并有相关报道显示：全球肺癌新发病例约为161万例，死亡约138万例，约占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13％及18％，居恶性肿瘤第一位。尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高，但肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的预后较差，5年生存率仍＜20％。

研究显示：癌症相关基因出现异常导致肿瘤细胞逃避凋亡、无限复制、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等现象的出现。传统的肿瘤治疗主要针对细胞DNA，这种传统治疗的方法往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，一些正常的细胞也被错杀。近些年来，肿瘤的诊断方法和治疗手段不断提高，尤其是靶向治疗的出现，使肿瘤的死亡率得到了有效的控制。靶向治疗具有高选择性和低毒性等优点，可以长期指导临床用药，其作用机理是针对肿瘤细胞特有的靶点设计结合药物，避免了传统治疗方法的缺点，从而达到抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用，对患者而言不仅延长了患者的生存时间还改善了患者的生存质量。

研究表明，EGFR基因突变主要发生在第19～21号外显子，包括第19号外显子的缺失突变，第20号外显子的片段插入和第21号外显子的点突变，约占EGFR基因突变的90％。第19号外显子的缺失导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失，从而改变了细胞对TKIs的敏感性；引起耐药的主要原因是第20号外显子第790位密码子(核苷酸位置2669碱基替换)出现T-M转换突变；第21号外显子的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。

目前，检测基因变异的技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法，方法简介于下：

Sanger测序法，即Sanger(桑格)双脱氧链终止法。其基本原理为每个反应含有所有四种脱氧核苷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧核苷酸而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的位置上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记，并将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，由于ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP(4种双脱氧核糖核苷酸)荧光标记不同，计算机即可根据颜色判断在这个位置上碱基究竟是哪一个(A、T、G、C)。