[发明专利]提高thaxtomin发酵产量的方法

说明书

本发明涉及一种通过异源表达thaxtomin生物合成基因簇发酵生产thaxtomin A、thaxtomin B或thaxtomin D的方法。在优选的实施方式中，进一步应用合成生物学策略，使用基因簇编辑技术对thaxtomin生物合成途径进行重新设计，将组成型强启动子元件插入到基因簇中的txtAB、txtED和/或txtC操纵子转录起始位点的上游，进而提高thaxtomin的产量。

技术领域

本发明涉及微生物工程领域。更具体而言，本发明涉及利用合成生物学方法对thaxtomin表达菌株的thaxtomin生物合成基因簇进行异源表达，提高thaxtomin的产量。

背景技术

thaxtomin是由植物病原体链霉菌产生的一类植物毒素，可造成植物块根或块茎发生木栓化疮痂状病变。已经发现thaxtomin抑制正在发育的植物细胞合成纤维素，因此能够将其作为天然除草剂，控制农田杂草生长而不对作物产生毒性(CN104284583A)。此外，还可将thaxtomin用于控制藻类污染(CN101677561A)。目前已知产生thaxtomin的链霉菌有4种，分别是疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)、酸性疮痂链霉菌(Streptomycesacidiscabies)、番薯链霉菌(Streptomyces ipomoea)以及肿痂链霉菌(Streptomycesturgidiscabies)。

已报道制备包括thaxtomin A、thaxtomin B、thaxtomin C和thaxtomin D在内的多种thaxtomin类化合物的化学合成方法(J.Gelin等，J.Org.Chem.58，1993，第3473-3475页；J.Moyroud等，Tetrahedron 52，1996，第8525-8543页；US20140275541)。另外，加拿大已经批准将灭活的酸性疮痂链霉菌RL-110^T菌株直接用作除草剂。然而目前，发酵生产thaxtomin类化合物的工艺仍存在发酵周期长(需要7-10天)以及产量低(天然产thaxtomin菌株的发酵产量一般为约20μg/mL)等缺陷。虽然本领域已预测出thaxtomin生物合成通路中的功能基因(Appl.Microbio.Biotechmol.，2013，97:8439-8453；Nature ChemicalBiology，8:814-816，2012；Antonie van Leeuwenhoek，2008，94:3-10；Francis IM等，2015，doi:10.1128/mBio.02018-14)，然而，本领域还没有能够有效改进thaxtomin合成通路从而提高thaxtomin产量的方法。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)的thaxtomin基因簇中的thaxtomin非核糖体肽合成酶A(TxtA)、thaxtomin非核糖体肽合成酶B(TxtB)、细胞色素P450型单加氧酶(TxtC)、NO合酶加氧酶(TxtD)以及4-硝基色氨酸合成酶(TxtE)，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、白色链霉菌(Streptomyces albus)以及委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)。

在第二方面，本发明提供了一种提高thaxtomin产量的方法，所述方法包括将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。

在第三方面，本发明提供了一种细菌，所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE；其中，所述细菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌。

附图说明