[发明专利]一种NK细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种NK细胞的培养方法。

背景技术

细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。治疗性的细胞包括：NK、γδT、CD3AK、DC-CIK等，其疗效、特异性、整体有效率、副作用反应等方面的情况逐步改善。

NK细胞(natural killer cell)也称自然杀伤细胞，属于淋巴细胞谱系细胞，含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞，对靶细胞的识别无MHC(主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex)限制，是重要的机体免疫细胞。NK细胞来源于骨髓，属于淋巴细胞谱系的大颗粒淋巴细胞，其占外周血淋巴细胞总数的5～10％，无特异性识别，不需经过抗原呈递及可直接杀伤肿瘤细胞，并且能分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能，在肿瘤治疗、抗病毒感染和清除异己细胞中有着重要的作用。

NK细胞在癌症肿瘤治疗方面取得了较大进展，主要是采取与手术、放化疗相结合的治疗方式，与传统单纯的放化疗相比，结合NK细胞的治疗，增强了患者的免疫功能或直接杀死肿瘤细胞和病毒感染的细胞，这样辅助因放化疗造成身体虚弱、抵抗力低而造成的二次伤害、容易感染生病等。而且细胞治疗可以有效抑制肿瘤细胞的转移扩散，并且没有副作用。

NK细胞是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线，是机体重要的免疫细胞。活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。目前，NK细胞已经广泛运用于临床进行肿瘤患者的治疗，同时，NK细胞治疗对病毒或细菌感染、免疫调节相关疾病以及抗衰老也有一定的疗效。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前，主要采用单纯的抗原递呈细胞与NK细胞共同培养的方法，来促进NK细胞的增殖。而这种采用单纯的细胞生长因子刺激NK细胞扩增的方法扩增得到的NK细胞纯度低，杀伤活力低；

目前，体外促进NK细胞的方法有很多，有在培养体系中加入动物血清进行培养，也有研究者将K562细胞通过基因修饰后经过辐照，然后作为饲养层细胞在体外刺激NK细胞的生长。上述方法虽然能够刺激NK细胞高效扩增，但是动物血清成分复杂，取材过程中有可能带入支原体、病毒，对NK细胞培养造成不确定性以及不安全性；K562本身作为一个肿瘤细胞，在临床安全性方面存在很大的质疑，不适用于临床NK细胞治疗；对培养的细胞缺乏正确的评定。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种NK细胞的培养方法。

本发明是这样实现的，一种NK细胞的培养方法，所述NK细胞的培养方法包括以下步骤：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；备用；

将常规培养的K562细胞接种于含10％～15％DMEM培养基中在36℃～37℃，6％～12％CO₂培养箱中孵育至少15h～20h，使之完全贴壁80％后备用；先用无血清培基洗涤备用的K562细胞；

接着更换无血清的DMEM培养液同步化8h～16h，然后加入2μmol/L～2.5μmol/L PBMC，置于36℃～37℃，10％～15％DMEM培养基培养箱中孵育60h～72h，从培养箱中取出，弃培养上清液，接着用0.01mol/L～0.05mol/L PBS溶液洗涤3次～6次，

然后采用基础培养基重悬，加入IL-2、IL-15，进行细胞培养，每隔3天补液一次，培养至第6～8天时加入K562细胞，培养16～18天获得NK细胞；

接种造模：用培养好的NK细胞接种于K562大鼠模型组；将NK细胞液0.05ml～0.1ml连续接种60天；分析大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现。

进一步，接种造模后还需进行RNA微阵列基因检测：60天后，将接种后的K562大鼠模型组大鼠处死，骨髓被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作；用MirVana microRNA isolation kit按照说明书收集总RNA；取适量RNA溶液，经紫外分光光度计定量测定RNA样品OD260和OD280值。