[发明专利]一种NK细胞的培养方法

权利要求书

1.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，所述NK细胞的培养方法包括以下步骤：

将外周血进行分离，得到PBMC细胞；备用；

将常规培养的K562细胞接种于含10％～15％DMEM培养基中在36℃～37℃，6％～12％CO₂培养箱中孵育至少15h～20h，使之完全贴壁80％后备用；先用无血清培基洗涤备用的K562细胞；

接着更换无血清的DMEM培养液同步化8h～16h，然后加入2μmol/L～2.5μmol/L PBMC，置于36℃～37℃，10％～15％DMEM培养基培养箱中孵育60h～72h，从培养箱中取出，弃培养上清液，接着用0.01mol/L～0.05mol/L PBS溶液洗涤3次～6次，

然后采用基础培养基重悬，加入IL-2、IL-15，进行细胞培养，每隔3天补液一次，培养至第6～8天时加入K562细胞，培养16～18天获得NK细胞；

接种造模：用培养好的NK细胞接种于K562大鼠模型组；将NK细胞液0.05ml～0.1ml连续接种60天；分析大鼠食量、皮毛、体重、活动量表现。

2.如权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，接种造模后还需进行RNA微阵列基因检测：60天后，将接种后的K562大鼠模型组大鼠处死，骨髓被迅速分离置于冻存管，直接放入液氮中冷冻，短时间内完成整个操作；用MirVana microRNA isolation kit按照说明书收集总RNA；取适量RNA溶液，经紫外分光光度计定量测定RNA样品OD260和OD280值。

3.如权利要求2所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，再计算RNA浓度，1％琼脂糖电泳观察总RNA，取3μg～6μg用Microcon centrifugal filter微离心过滤柱过滤，得到片段小于300个的小RNA；应用Poly聚合酶将小RNA的3’端加上poly(A)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，用于后续的荧光标记，完成μParafloTM microRNA微阵列基因。

4.如权利要求2所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，RNA微阵列基因检测后还进行表达实验和分析：通过微循环泵杂交仪器在μParafloTM微流体芯片上过夜，使用含甲酸胺SSPE缓冲液进行杂交，漂洗甩干，用激光扫描仪采集杂交图象，Array--Pro软件对杂交图像进行数字化转换、数据处理和分析，计算两组检测到信号的比值和t检验的p值，以p<0.01定义为信号有显著差异性，分析差异表达的位点，大鼠微阵列芯片包括454个microRNA，包含数据库中成熟的microRNA和部分成熟microRNA的互补链；芯片上的检测探针均进行27个重复，实验进行6次。

5.如权利要求4所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，表达实验和分析后还需进行：

实时荧光定量PCR检测：用MirVana microRNA isolation kit按照说明书收集总RNA，计算RNA浓度；特异逆转录引物从Taqman MicroRNA Assays获得，并用Taqman MicroRNA ReverseTranscription Kit将RNA反转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测，反应结束后用ABI Prism7900软件分析结果，PCR实验进行6次，用比较阈值循环方法分析数据，得到Ct值，即荧光达到阈值所需的PCR循环数，并分析基因相对表达量。

6.如权利要求5所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，实时荧光定量PCR检测后需进行生物信息学预测：应用miRanda、TargetScan和PicTar 3个生物信息学靶基因预测软件，对microRNA芯片结果中挑选出来的microRNA的靶基因做出预测。

7.如权利要求6所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，生物信息学预测后需进行统计学处理：根据资料的性质、分布和设计特点，应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。

8.如权利要求4所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，用激光扫描仪采集杂交图象方法包括：

对K562大鼠模型进行超声探查所用探头为L15-7io浅表探头，对骨髓异常回声记录，并测量大小后采集图像；

对构建的K562大鼠模型进行Micro CT增强扫描，Micro CT采用的造影剂为Fenestra LC，造影剂用量为0.4ml/20g，每次扫描采取的增强方式：注入造影剂后4小时进行扫描；

对构建的K562大鼠模型进行磁共振骨髓横断位及冠状位扫查，扫描序列：T2WI横断面及冠状位。