[发明专利]一种检测人及动物血清抗RVF病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条

权利要求书

1.一种检测人及动物血清抗RVF病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条含有：胶体金标记的特异性RVF病毒重组抗原的玻璃纤维膜、包被有特异性RVF病毒重组抗原的检测线和包被有鼠抗-RVF病毒重组抗原单克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜；待测样本中的抗RVF病毒抗体先与胶体金标记RVF病毒重组抗原反应，然后硝酸纤维素膜上对应的特异性RVF病毒重组抗原反应，形成特异性RVF病毒重组抗原-特异性RVF病毒抗体-胶体金标记RVF病毒重组抗原夹心复合物，通过胶体金颗粒特有的颜色示踪而判断特异性抗体的有无。

2.根据权利要求1所述的一种检测人及动物血清抗RVF病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述特异性RVF病毒重组抗原的制备方法为：

(1)分离得到RVF病毒的病毒株，用RNA提取试剂提取出RVF病毒的RNA；

(2)以RVF病毒株的基因组为模板，通过PCR扩增得到N蛋白基因产物；

(3)用内切酶BamHI和Sal I酶切处理在目的基因两侧带有限制性内切酶BamHI和Sal I识别位点的所述RVF病毒株N蛋白基因PCR产物，与经相同酶切处理的表达载体pQE 30连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌的感受态细胞，得到阳性克隆重组质粒；用终浓度0.3mmol/L的IPTG进行诱导表达，表达产物经纯化后即获得特异性RVF病毒重组抗原。

3.一种如权利要求1至2任意一项所述的一种检测人及动物血清抗RVF病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

S1、制备胶体金标记的特异性RVF病毒重组抗原的玻璃纤维膜：

(1)胶体金溶液的制备：

用王水浸泡容器一定时间，然后用超纯水清洗干净，烘干；取1％氯金酸1mL加入到去离子双蒸水中至终体积为100mL，得到的氯金酸浓度为0.01％，将得到的氯金酸加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

(2)金标特异性RVF病毒重组抗原的制备：

取上述制备的胶体金溶液，用0.1mol/L NaOH调节pH至6.0-8.5；用磷酸盐缓冲液(PB)将特异性RVF病毒重组抗原的稀释至抗原浓度为0.3-1.0mg/mL；取所述稀释液，在4℃条件下2400r/min离心28min，吸取上清液，弃去沉淀，边搅拌边将上清液逐滴加入到上述调节好pH的胶体金溶液中，静置；加入稳定剂，在4℃条件下2400r/min离心28min，静置,弃上清，留沉淀物，用缓释剂重悬，即得到胶体金标记的特异性RVF病毒重组抗原；

(3)将标记好胶体金的特异性RVF病毒重组抗原溶液均匀涂布到已经处理好的玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，制备成胶体金垫，备用；

S2、制备包被有特异性RVF病毒重组抗原的检测线和包被有鼠抗-特异性RVF病毒重组抗原单克隆抗体的质控线的硝酸纤维素膜：

将特异性RVF病毒重组抗原稀释成1mg/mL，将鼠抗-特异性RVF病毒重组抗原单克隆抗体稀释成1mg/mL；将稀释好的特异性RVF病毒重组抗原均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的鼠抗-特异性RVF病毒重组抗原单克隆抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，室温包被过夜，封袋备用；

S3、制备试纸条：

将样品垫在封闭液中浸泡40min，烘干，封装备用；将PVC底板、硝酸纤维素膜检测层、样品垫、玻璃纤维素膜和吸水垫组合，PVC底板上硝酸纤维素膜的上方粘帖吸水纸，硝酸纤维素膜与吸水纸相互交叠0.2mm，在硝酸纤维素膜的下方依次粘贴玻璃纤维膜和样品垫，硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜之间以及玻璃纤维膜与样品垫之间相互交叠0.2mm，即得所述检测人及动物血清抗RVF病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条。

4.根据权利要求3所述的一种检测人及动物血清抗RVF病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金标记特异性RVF病毒重组抗原用pH调节剂调节pH值为6.0-8.5，所述的玻璃纤维素膜上的胶体金标记特异性RVF病毒重组抗原的含量为0.05～0.2μg/cm²。

5.根据权利要求3所述的一种检测人及动物血清抗RVF病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的检测线中所述的特异性RVF病毒重组抗原的含量为0.06～0.09μg/cm²。