[发明专利]一种雷帕霉素的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种雷帕霉素的分离纯化方法。

背景技术

雷帕霉素(又名“西罗莫司”)是科学家于1975年首次从智利复活节岛的土壤中发现的一种由土壤链霉菌分泌的次生代谢物，其化学结构属于“三烯大环内酯类”化合物。是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，为白色固体结晶，熔点为183-185℃，亲脂性，溶解于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，极微溶于水，几乎不溶于乙醚。

雷帕霉素作为一种重要的免疫抑制剂，在临床上具有广泛的应用，包括用于治疗器官移植的排斥反应、可用于治疗阿尔茨海默症等，但由于其在制备过程中提取工艺复杂、收率低等，导致其产量低，价格昂贵。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种雷帕霉素的分离纯化方法，可在分离纯化阶段提升雷帕霉素的收率和纯度。

一种雷帕霉素的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)收集含有雷帕霉素的发酵液，过滤，分离得到发酵液和菌丝体；

(2)向菌丝体中加入为其3～5倍体积的丙酮，在20～30Hz、400～800r/min条件下搅拌1～2h，过滤，得菌丝体提取液；

(3)将菌丝体提取液和发酵液胺体积比为1:1的比例混合，然后加入混合液2～3倍体积的乙酸乙酯-丙酮混合物，萃取2～3次，每次3～5h，合并萃取液，向合并后的萃取液中加入活性炭，搅拌30～40min，过滤，减压浓缩，然后溶解，再加入溶解液1～2倍体积的90％～95％乙醇，搅拌均匀，静置30～50min，过滤，将滤液蒸干，得雷帕霉素粗品；其中，乙酸乙酯和丙酮的体积比为2～3.8:1～2.5；活性炭在萃取液中的浓度为0.05～0.12g/L；

(4)用乙酸乙酯-丙酮混合物溶解雷帕霉素粗品，并将其加入硅胶层析柱中，用乙酸乙酯-丙酮混合物作为流动相进行梯度洗脱，每次洗脱2～3个柱体积，分段收集洗脱液，经薄层层析检测后，合并馏分；其中，乙酸乙酯和丙酮的体积比为1～2:0～20；

(5)蒸干浓缩合并后的馏分，乙醇溶解，再用乙醚重结晶2～3次，得分离纯化后的雷帕霉素。

进一步地，步骤(2)中搅拌条件为：28Hz、600r/min，搅拌2h。

进一步地，步骤(3)中乙酸乙酯和丙酮的体积比为2.8:1.4。

进一步地，步骤(3)中乙醇浓度为95％。

进一步地，步骤(4)中梯度洗脱的具体过程为：

将乙酸乙酯和丙酮分别按照体积比为1:0、2:1、1:2、1:6、1:20的比例依次进行梯度洗脱，每次洗脱3个柱体积。

本发明的有益效果为：

1、在20～30Hz下，超声搅拌，可最大化的提升菌丝体内各项有效成分的扩散，提升后续丙酮提取的产物得率。

2、由于雷帕霉素为一种极性比较小的物质，因此，在进行后续提取时，采用乙酸乙酯和丙酮混合的方式，能够更加完全的提取出菌丝体提取液和发酵液中的有效成分，同时，虽然雷帕霉素主要存在于菌丝体中，但发酵液中也存在部分雷帕霉素，因此，将两者结合一同进行萃取，可最大化的提升雷帕霉素的收率。

3、步骤(3)中萃取液先用活性炭吸附脱色，由于萃取过程中，有机萃取剂不仅会将雷帕霉素萃取出来，还会将别物质萃取出来，由此通过90％～90％乙醇处理，可使萃取液中的糖类等物质析出，提升后续处理液中雷帕霉素的纯度。

4、在步骤(3)处理后，降低了萃取液中的杂质含量，再通过硅胶层析柱梯度洗脱，然后根据薄层层析检测结果将馏分进行合并，提升雷帕霉素的纯度；采用乙酸乙酯和丙酮混合液作为流动相进行梯度洗脱，可将萃取液中的雷帕霉素完全洗脱下来，使硅胶柱中的吸附量达到最小化，降低处理过程中产物的损失，以使产物得率最大化。

5、本发明方法在提升雷帕霉素得率和纯度的基础上，操作过程无需使用昂贵的试剂和设备，大大降低了制备成本。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1

一种雷帕霉素的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)收集含有雷帕霉素的发酵液，过滤，分离得到发酵液和菌丝体；