[发明专利]DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法

说明书

本发明公开了一种DNA探针‑菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，包括：预处理、杂交、筛选，通过特定的正向引物与反向引物，经经聚合酶链式反应扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针，将待测试菌株的DNA与DNA探针进行杂交作用，通过显色测试杂交匹配结果筛选出产毒菌株。有益效果为：本发明方法可在8‑10小时内完成90个样品筛选，方法快速高效，特异性强，而且准确性高；本发明方法操作步骤简单，工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为生化试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，分析成本低廉，具有较高的市场前景与经济价值。

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，尤其是涉及一种DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法。

技术背景

麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish posoning，PSP）在已知赤潮毒素中毒性最强、分布最广、威胁性最大、引发毒害事件最频繁。其主要由石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）及其衍生物组成，属于胍胺类毒素，是典型的钠离子通道阻断剂。目前已发现的PSP同系物多达58种。其生物合成基因为sxt基因簇。STX在赤潮检测、分子生物学、神经生物学、医学诊断、药物开发、军事生化武器战剂等研究中均有重要应用。在医学诊断与药物开发方面，STX独特的化学结构和毒理作用机制，成为研究细胞Na⁺通道的重要工具药。其具有抗肿瘤、抗病毒、镇痛、麻醉、解痉、降压、止喘等多种功效。其局部麻醉效果比普鲁卡因或可卡因强至少10万倍。

目前，PSP的获得主要通过甲藻的规模化培养及产物提取制备而来。该方法周期长、成本高；且需要特殊的藻培养设备。与甲藻相比，细菌具有基因组小、易培养、遗传操作简单等特性，因此，利用产毒菌株发酵与产物分离制备PSP贝毒，是一条行之有效的替代方法。其关键是产毒菌株的快速筛选。其可通过微生物发酵、代谢产物提取、产物化学分析来完成。但工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。而目前尚无产麻痹性贝毒菌株的快速筛选技术。

发明内容

本方法的目的在于提供一种DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，所使用的探针具有与目标DNA特异性结合及杂交快速性，本发明的检测方法具有检测速度快、准确性高、灵敏度高的特性。

本发明方法中所用的亚硫酸杆菌（Sulfitobacter sp.）（CCTCC AB 2016296）、赫夫勒氏菌（Hoeflea sp.）（CCTCC AB 2016294）均购买自中国典型培养物保藏中心；本发明方法中所用的大肠杆菌（Escherichia coli）（ATCC 25922）、宋氏志贺氏菌（Shigellasonnet）（ATCC 29930）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 6538）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（ATCC 23857）、铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）（ATCC 27853）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）（ATCC BB120）、杀鲑弧菌 （Vibriosalmonicida）（ATCC 43839）、腔隙莫拉氏菌（Moraxella lacunata）（ATCC 17952）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）（ATCC 14029）此九种菌株均购买自美国模式培养物集存库(American type culture collection)。