[发明专利]DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法

权利要求书

1.DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于，所述的DNA探针为经地高辛标记含有254个碱基序列1所述的单链DNA探针，所述的序列1为：GATGTCTGGACTACGTCCCTCCTACTCGCGCTGTCGAACCTGAATATCGATCCGAGGACGCCGGCTGGGGCTTCGCCGACGCGGGCTCGGCGCGCATGGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTGAACGTCGGCAGGACCCTGCAGCACCAAGTCCAGCACCGCACGTTCGTGCAGCAGATCAGCGCCGTTTGAGGGCGAGTTCGCCTCGCATCGCGTCGTGGCAGACGGGATTAGGCAGATCTACAGAAGTC；

所述的DNA探针为通过特定的正向引物17a与反向引物17b，经聚合酶链式反应(PCR)扩增合成了以地高辛标记的单链DNA探针；

所述的方法包括：

1)预处理：制作并固定待测试菌株的DNA；

2)杂交：将待测试菌株的DNA与DNA探针进行杂交作用；

3)筛选：通过显色测试杂交匹配结果。

2.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的正向引物17a，序列为：TAGTAGGAGTAGCACGCTGCA；所述的反向引物17b，序列为：TCCTTCCTRGACCACGA。

3.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的预处理步骤为：制作10cm-12cm×10cm-12cm的硝酸纤维素膜，取待测试菌株单菌落点于硝酸纤维素膜，浸于0.50-0.52MNaOH溶液8-10分钟，取出自然干燥后夹在两张干滤纸之间，放置于真空烤箱中，78-80℃烘2-2.5小时；在TE缓冲液中加入溶菌酶，放入DNA膜，在36-37℃温度下作用30-32分钟后用TE缓冲液漂洗；将DNA膜置于10-12mL杂交缓冲液中，40-42℃温育1.5-2.0小时。

4.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的杂交步骤为：将以地高辛标记的DNA于沸水中煮10-15分钟变性，置冰浴中，取5.0-6.0mL标记DNA加入到2.5-3.0mL杂交缓冲液中，将膜由杂交缓冲液中取出置于塑料薄膜上，加入含地高辛标记DNA探针的杂交缓冲液中，40-42℃下作用2.0-2.5小时；将膜放至盛有2.0-3.0×SSC溶液的平皿内，洗涤2-3次，每次5-6分钟。

5.根据权利要求1所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的筛选步骤为：将膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1-2分钟，弃去洗涤液；加入20-22mL 1.0-1.2％的封闭液，室温放置60-70分钟，弃去溶液；加入20-25mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，36-37℃温育30-35分钟，弃去抗体结合物，用冲洗液洗涤3-4次，每次40-50mL；在显色缓冲液中平衡2-3分钟后，倾倒显色缓冲液，将膜置于塑料袋内；加入BCIP/NBT显色液中，置于暗处，待显色后加入TE溶液终止反应，有斑点出现，即表示菌株产毒阳性；无斑点，即表示菌株产毒阴性。

6.根据权利要求3所述的DNA探针-菌落原位杂交技术筛选麻痹性贝毒产生菌株的方法，其特征在于：所述的预处理步骤中的溶菌酶的用量为每毫升TE缓冲液加入4.8-5.2mg溶菌酶；杂交缓冲液为：5×SSC溶液、50-52mM磷酸缓冲液、1.0-1.1mMEDTA、10-12％硫酸葡聚糖、48-50％去离子甲酰胺，pH7.0-7.1。