[发明专利]一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒。所述方法包括如下步骤：S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗HBV药物，进行培养，S2、检测培养上清液中HBV pgRNA浓度，S3、根据培养上清液中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。所述试剂盒中含有上游引物、下游引物和荧光标记探针以及逆转录引物，其序列分别为序列表序列1—4序列。本发明具有检测灵敏度高、敏感，检测过程简便、周期短的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒。

背景技术

乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是由乙型肝炎病毒HBV感染引起的疾病。乙型肝炎病毒HBV属于嗜肝DNA病毒科，正嗜肝DNA病毒属，基因组长约3.2kb，是一种部分双链环状DNA。在HBV感染者的血液中，电镜下可以同时观察到三种不同的病毒颗粒：包括直径为42nm的大球形颗粒，为完整的病毒颗粒，具有传染性，也称为Dane颗粒；还可以见到直径22nm的小球形颗粒和管形颗粒。小球形颗粒和管形颗粒为乙型肝炎表面抗原，没有核酸，无传染性。

乙型肝炎病毒HBV外面有一层包膜，上面有乙肝表面抗原，包膜里面是病毒的核心颗粒，其内为乙肝的核酸和聚合酶。HBV的核酸为部分双链的DNA，又称为环状松弛DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，其基因组编码HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶和HBx蛋白。HBV含4个部分重叠的开放读码框(ORF)，即：前S/S区、前C/C区、P区和X区。HBV编码四种不同长度的mRNA，分别长3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb。

根据HBV全基因序列差异≥8％或S区基因序列差异≥4％，HBV可分为不同的基因型，各基因型又可分为不同亚型。目前，HBV至少有9个基因型(A～I)，我国以B型和C型为主。HBV基因型与疾病进展和干扰素治疗应答有关，与C基因型感染者相比，B基因型感染者较少进展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HBeAg阳性患者对干扰素治疗的应答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型。

当乙型肝炎病毒HBV进入人体后，有感染性的HBV病毒颗粒顺着人体的血液循环不停的前进。乙型肝炎病毒HBV属于嗜肝DNA病毒，对肝脏细胞具有特异性的感染力。因此，当HBV顺着血液循环到达肝脏时，HBV便会进入肝脏细胞。近来研究发现，肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸-协同转运蛋白(NTCP)是HBV感染所需的细胞受体。首先，HBV特异性的与肝脏细胞上的NTCP受体结合从而吸附到肝脏细胞上，脱掉最外面的包膜，HBV病毒的核心颗粒核衣壳或者称作衣壳体进入肝脏细胞的包浆之中。之后核心颗粒在包浆中释放出其内的HBVDNA，即rcDNA，rcDNA进入细胞核，形成共价闭合环状DNA(covalentlt closed circularDNA，cccDNA)，以cccDNA为模板，转录形成前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)和其它mRNA，pgRNA在逆转录酶的作用下形成rcDNA。一方面，rcDNA与相关mRNA表达的蛋白组装形成HBV病毒颗粒，覆盖包膜后释放进入血液中；另一方面，rcDNA会重新进入细胞核内，形成新的cccDNA。这就形成了一个“cccDNA池”，由于“cccDNA池”的存在就使得细胞一直处于被感染状态。

对于慢性乙型肝炎患者，现在公认的最基础的治疗是抗病毒治疗，包括干扰素(IFN)和核苷(酸)类似物(NA)。干扰素包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素，也可称为短效干扰素和长效干扰素；核苷(酸)类似物现在国内批准的药物有5种，分别是拉米夫定(简称M或LAM)、阿德福韦(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF)。M等核苷(酸)类似物的主要的作用位点为HBV的逆转录酶。