[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症因子分泌量影响的方法

权利要求书

1.一种检测电子烟气溶胶水提物细胞炎症因子分泌量影响的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中，加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为1mL/孔接种到12孔细胞培养板中，然后将12孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露：

取出12孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

表1 电子烟气溶胶水提物对细胞炎症效应因子分泌量影响的检测加样表

(6)受试物孵育品的收集：培养完成后，分别收集12孔细胞培养板每孔中的上清液，1000rpm离心20min，然后用不同的1.5ml离心管分别收集各孔的离心后上清液备用；

(7)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；

(8)加样：取96孔酶标板，在空白对照孔中加PBS磷酸盐缓冲液100ul，其余孔分别加标准曲线溶液和备用的离心后上清液各100ul，酶标板覆膜，37℃，孵育90分钟；

(9)加入抗体：加样孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，每孔加入抗体工作液100ul，盖酶标板覆膜，37℃，孵育60分钟；

(10)洗板、加酶：加抗孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350ul/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板3次；然后在每孔中加酶结合工作液100ul，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；

(11)洗板、显色：加酶孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350ul/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板5次；然后在每孔中加底物工作液90ul，盖酶标板覆膜，37℃孵育，30min后加入终止液50ul/孔；

(12)测量吸光值：在酶标仪450nm下检测吸光度；

(13)细胞炎症因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算样品的细胞炎症因子分泌量。