[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症因子分泌量影响的方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体是涉及一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提物，检测其对细胞炎症效应因子分泌量影响的方法。

背景技术

随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的烟液转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟研发人员在烟液产品配方设计初期，将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整后形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试技术对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，并无统一的标准方法。

同时，电子烟烟液雾化后进入口腔和呼吸道，经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。而现有技术通常是直接对电子烟液本身进行分析测试，未考虑其抽吸时的形态、迁移等过程，导致分析测试的结果不能准确反应电子烟烟雾对细胞炎症效应因子分泌量的真实影响。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症效应因子分泌量影响的方法，为电子烟烟液的安全性评估提供参考。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症效应因子分泌量影响的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中，加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为1mL/孔接种到12孔细胞培养板中，然后将12孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露：

取出12孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

表1电子烟气溶胶水提物对细胞炎症效应因子分泌量影响的检测加样表

(6)受试物孵育品的收集：培养完成后，分别收集12孔细胞培养板每孔中的上清液，1000rpm离心20min，然后用不同的1.5ml离心管分别收集各孔的离心后上清液备用；

(7)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；

(8)加样：取96孔酶标板，在空白对照孔中加PBS磷酸盐缓冲液100ul，其余孔分别加标准曲线溶液和备用的离心后上清液各100ul，酶标板覆膜，37℃，孵育90分钟；

(9)加入抗体：加样孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，每孔加入抗体工作液100ul，盖酶标板覆膜，37℃，孵育60分钟；