[发明专利]具改善骨质疏松作用的多肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

脱脂：将鹿骨以CO₂超临界萃取的方式进行脱脂；

研磨：将上述脱脂后的鹿骨通入液氮进行研磨，得骨粉；

提取蛋白：先将所述骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于Tris-HCl缓冲溶液中，在15-30℃下以匀浆器研磨20min，3400-5000转/min离心15-25min，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，回收溶剂，得到热不稳定性蛋白，待用；

再将骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于Tris-HCl缓冲溶液中，在100-150℃的条件下提取1.5-2.5h，3400-5000转/min离心15-25min，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，回收溶剂，得到热稳定性蛋白，待用；

蛋白纯化：将上述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白混合，以葡聚糖凝胶柱纯化，得到平均分子量为15-19KD的鹿骨蛋白；

发酵：将乳酸菌浓度为3.5×10¹⁰-4.5×10¹⁰个/m L的菌悬液按体积百分比为4-8％的量接种至鹿骨蛋白发酵培养基中进行培养，所述鹿骨蛋白发酵培养基通过以下方法制备得到：按照鹿骨蛋白2.5-3.5g/100ml，玉米粉0.15-0.25g/100ml，NaCl 0.4-0.6g/100ml的浓度配制溶液，调节pH值为7.0，灭菌，即得；

将乳酸菌接种至鹿骨蛋白发酵培养基后，于35-45℃，pH7-9，90r/min转速的条件下培养24-40h，发酵液经,4000-5000r/min离心15-25min，取上清液，通过超滤柱过滤，截留得到平均分子量为5KD-10KD的多肽，即得。

2.根据权利要求1所述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，在所述脱脂步骤之前，还包括预处理步骤，所述预处理步骤为：取鹿骨，剔除非骨成分，清洗干净，粉碎至体积为1-2cm³的碎块。

3.根据权利要求1所述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，所述脱脂步骤中，CO₂超临界萃取的条件为：压力为15-35MPa，温度为20-25℃，时间为100-140min，CO₂流量为15-25L/min。

4.根据权利要求1所述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白纯化步骤中，将所述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白按照质量比为1:0.5-1.5混合，以葡聚糖凝胶柱G-50纯化，得到平均分子量为15-19KD的鹿骨蛋白。