[发明专利]一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法

说明书

本发明公开了一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法：采用共混培养液培养NK细胞，培养7天；然后，改用自体血浆培养基培养，培养过程中每2～3天进行一次补液，维持细胞密度在2.0×10⁶/mL，培养20天以上；所述共混培养液的组成如下：在淋巴细胞培养基的基础上，添加1～10％自体血浆，200～1500IU/mL的IL‑2，10～50ng/mL的IL‑15和10～50ng/mL的IL‑21；所述自体血浆培养基的组成如下：在无血清培养基的基础上，添加1～10％自体血浆，200IU/mL的IL‑2。本发明的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，以脐血或自体外周血为细胞来源，培养过程中无需滋养细胞，扩增效率高，所得NK细胞的纯度高。通过该方法获得的NK细胞，可作为细胞免疫疗法的医药组合物，主要用于治疗和/或预防传染病和/或癌症。

技术领域

本发明涉及一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法。

背景技术

自然杀伤细胞(nature killer cell，NK cell)属于人体介导固有免疫细胞，与机体抵抗恶性肿瘤、病毒感染和免疫调节密切相关。其免疫表型特征主要为CD3-/CD56+，是一种不表达T细胞受体，也不表达B细胞受体的淋巴细胞亚群。其对肿瘤细胞或受感染细胞的杀伤既不依赖抗体参与，也不需要抗原刺激和致敏；识别靶细胞无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制，可直接与靶细胞接触释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞；也可释放NK细胞毒因子与靶细胞的NK细胞毒因子(NK cytotoxic factor,NKCF)受体结合，选择性杀伤和裂解靶细胞；或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)对靶细胞造成杀伤。NK细胞在肿瘤免疫中的重要作用，使得NK细胞过继免疫疗法成为一种治疗肿瘤的新策略。

存在于健康人体内的大部分NK细胞通常处于免疫静止状态，一旦被激活，它们将渗透到大多数组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。很多研究人员进行了将NK细胞活化的研究。

NK细胞约占血液中淋巴细胞的5％～10％，而在细胞疗法中充足的细胞数量和细胞纯度是NK杀伤肿瘤细胞作用的重要因素，但NK细胞的增殖很弱，无法提供充足数量的细胞进行给药，这成为将其应用于临床的最大的问题。因此，寻求一种在体外获得足够数量和纯度NK细胞的有效方法，仍然是学者们致力研究的热点课题。

用于肿瘤免疫治疗的NK细胞主要通过体外诱导扩增技术获得，其前体细胞主要来源于自体外周血、异体(异基因)外周血和脐带血的单个核细胞。传统的NK细胞体外扩增方案采用IL-2短期刺激外周血淋巴细胞，但细胞生长倍数有限，细胞增殖10倍左右，因此需要大量的单个核细胞，需要从病人身体中采集大量的外周血才能够初步达到治疗的剂量，这对病人是一个很大的生理负担。

目前，还有关于有些研究人员将肿瘤细胞株用作滋养层细胞(feeder cell)来增殖NK细胞的报道，滋养层细胞的加入虽然能够在无衰老现象的前提下大量扩增NK细胞，但其在临床应用上仍存在许多问题，例如NK细胞在体外持续培养数周后，在输入人体前，需提前移除滋养细胞并确保无任何残留，在失去该最适生长条件后，NK的细胞毒性可能会下降，输注体内后的可持续性也难以保障；而添加异体细胞作为滋养层细胞，尤其是K562癌细胞株，在临床应用上也存在重大风险与伦理问题。

综上所述，开发一种无滋养层细胞的NK细胞扩增方法，以获得高纯度和大数量的NK细胞，具有极大的应用前景。

CN104789527A公开了一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，在重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A共同作用下激活自然杀伤细胞增殖，CD56+/CD16+表型均大于80％。

发明内容