[发明专利]一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法

权利要求书

1.一种无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：采用共混培养液培养NK细胞，培养7天；然后，改用自体血浆培养基培养，培养过程中每2～3天进行一次补液，维持细胞密度在2 .0×10⁶/mL，培养20天以上；

所述共混培养液的组成如下：在GT-T551H3培养液的基础上，添加5％自体血浆，200IU/mL的IL-2，50ng/mL的IL-15和25ng/mL的IL-21；

所述自体血浆培养基的组成如下：在GT-T551H3培养液的基础上，添加1～10％自体血浆，200IU/mL的IL-2。

2.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述采用共混培养液培养NK细胞时，初始单个核细胞的细胞密度为1 .5×10⁶cells/ml。

3.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述采用共混培养液培养NK细胞时，培养条件为：37℃，5％CO₂，饱和水蒸气，培养过程中每三天进行一次补液。

4.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述用自体血浆培养基培养时，初始细胞密度为2.0×10⁶cells/ml。

5.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述用自体血浆培养基培养时，培养条件为：37℃，5％CO₂，饱和水蒸气。

6.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述自体血浆为灭活的自体血浆，灭活的方式为：56℃水浴30min，2000g离心10min。

7.根据权利要求1所述的无滋养细胞的NK细胞的扩增方法，其特征在于：所述NK细胞，以脐血或外周血为细胞来源，通过以下方法得到：

1)在生物安全柜内，将血液分装到50ml离心管中，每管血液30ml，经500g离心10min；

2)离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中，56℃水浴灭活30min，2000g离心10min，留上清备用；

3)用生理盐水按照1:1的比例稀释血细胞，以2:1的比例将混匀的血细胞缓慢加到装有淋巴细胞分离液的离心管中，使其呈清晰的界面，400g离心20min；

4)离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、淋巴分离液层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中；

5)将白膜层细胞加生理盐水洗涤两次，300g离心10min；用培养基重悬，即为单个核细胞。