[发明专利]一种提取和检测根际土壤细菌群感信号分子的方法

说明书

技术领域

本发明属于提取和检测技术领域，尤其涉及一种提取和检测根际土壤细菌群感信号分子的方法。

背景技术

根际(Rhizosphere)被定义为紧密围绕着有生命力根系的生物活性区域，其中包含大量微生物，例如细菌、放线菌和真菌等，也包括一些藻类和病毒等，范围一般为距离根表面1cm以内。不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物会对根际微生物的生长发育产生影响；而根际微生物又参与土壤有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环等多种生理生化过程。

植物通过根系分泌物对根际微生物进行选择，因此根际微生物群落在组成与结构上与非根际土壤存在显著差异。为适应来自植物的选择压力，微生物在根际定殖过程中释放出多种群体感应化合物（quorum sensing components, QS），以帮助某些微生物探测适合的生态位，因此产生了根际微生物群落的趋异化（heterogeneity）发展。同时，QS化合物对寄主也产生了显著影响，被认为是病原菌聚集入侵和共生菌侵染根系早期的信号。研究表明，微生物群感系统中除真菌以小分子寡肽作为信号分子外，酰化高丝氨酸内酯(Acyl-homoserine lactones，AHLs)是迄今为止发现的细菌群体感应系统中最普遍和最重要的一类信号分子。该类化合物均含有一个高丝氨酸内酯环和4-14个碳不等的酰基侧链，因此常被分为短链（C4-C6）、中链（C8-C10）和长链（C12-C14）三种类型（Scott et al., 2006）。迄今为止，细菌产生的多种AHLs被发现分离，但土壤中AHLs由于受到土壤复杂成分的影响以及当前检测技术的影响一直无法准确测定。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提取和检测根际土壤细菌群感信号分子的方法，本发明采集时可以确保准确的采集到最近时间内生长的细根以及根基土；先加入水，然后加入乙酸乙酯进行对泥浆的提取，通过这种方法来提升溶解效率，缩短萃取时间；在收集根际土后在土壤中加入变色硅胶以进行土壤干燥，可以使土壤更宜脱落，能使较湿润的根际土更快速和准确的得到，且加入变色硅胶对细根根际土中AHLs的含量准确性测定并无影响；进行检测，可以准确的计算最后结果，尽可能的避免在实际操作产生的人为误差，从而避免了AHLs测定量的不准确。

本发明是通过如下技术方案实现的，提供一种提取和检测根际土壤细菌群感信号分子的方法，包括以下步骤：

1）样品采集：随机选择固定样地中一个标准地的杨树，在每颗杨树的距树干基部0.5 m的距离埋设内生长管，将埋设的内生长管带回实验室；埋设中会造成一系列根系的机械损伤，而伤根在一定时间内会修复并且继续生长，所以内生长管可以确保准确的采集到最近时间内生长的细根以及根基土；

2）收集根际土：将杨树细根放入离心管中，用涡旋震荡器进行震荡，将细根表面的土壤作为根际土；杨树细根，在无菌条件下分离细根，将细根放入离心管中，由于根际土附着在根际表面很难取得，所以用涡旋震荡器震荡进行细根表面的土壤作为根际土，由于土壤的根际附着能力与土壤的性质和湿润度有关，所以按照不同的震频来进行震荡，以更好的使根际土脱落进行收集；

3）土壤提取液中AHLs 的测定：在离心管中加入根际土，加内标物，然后加入水，涡旋震荡浸提，接着加入乙酸乙酯，再涡旋萃取后离心，吸取上层乙酸乙酯相，旋转蒸发至干，然后加入甲醇和水混合液，震荡均匀，通过尼龙过滤膜后于进样瓶中，HPLC-MS测定。为了可以充分的提取，先加入水，然后加入乙酸乙酯进行对泥浆的提取，通过这种方法来提升溶解效率，缩短萃取时间。

作为优选，步骤1）将埋设的内生长管按照取样点编号在低温条件带回实验室。这样可以保证在短时间内细根以及根际土的理化性质。

作为优选，步骤2）收集根际土后在土壤中加入变色硅胶以进行土壤干燥。为了能使较湿润的根际土更快速和准确的得到，可以在土壤中加入变色硅胶以进行土壤干燥，这样可以使土壤更宜脱落，为了确保细根根际土中AHLs的含量准确性，后续我们做了有无变色硅胶添加的对比试验，结果验证了预期效果，对AHLs并无影响。

作为优选，步骤3）中，加水后涡旋震荡10分钟，浸提30分钟。

作为优选，步骤3）中，加入乙酸乙酯后涡旋萃取10分钟，以4500r·min-1 离心5min。

作为优选，步骤3）中，加入甲醇和水混合液的比例为2:8。在测定中，选择用2:8的甲醇与水的比例定容，可以避免由于有机溶剂的浓度太高，而导致的色谱峰不对称，或出峰时，峰图过于细长。