[发明专利]基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法

说明书

本发明公开一种基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法，属于寨卡病毒分子诊断技术领域。本发明分别提出了基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法。该方法具有如下优点：1)灵敏度高；2)探针稳定：线性及树状三联吡啶钌聚合物作为探针的电化学发光放大部分，性能稳定、聚合度及发光强度均一；3)检测过程简单、快速：经过简单的样品前处理及核酸提取过程即可进行寨卡病毒检测、耗时短，省去了扩增步骤，检测快速；4)成本低。本发明为寨卡病毒核酸检测技术体系，提供了新型基于电化学发光方法技术的分子诊断方法，有效的弥补了现有寨卡病毒检测技术单一，提供了无需扩增的寨卡病毒检测方法。

技术领域

本发明属于寨卡病毒分子诊断技术领域，特别涉及一种基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法。

背景技术

寨卡病毒(Zika virus)，隶属于黄病毒科，为单正链RNA病毒。最早分离于乌干达维多利亚湖附近的寨卡森林中一只发热的恒河猴(1947年)，其主要通过蚊媒途径传播。2015年，寨卡病毒在巴西大面积爆发，造成150万人感染，以及4000多例小脑畸形的新生儿，截至2017年3月10日，全球84个国家都出现寨卡病毒感染案例。寨卡病毒感染后，患者多为流感样表现，一般能自愈，少数患者出现格林－巴利综合征，孕妇感染寨卡病毒和新生儿小头畸形有关，因此，开发新型寨卡病毒分子诊断新方法，对于降低寨卡病毒感染的危害具有重要意义，可有效预防新生儿小头畸形。

目前，寨卡病毒感染的诊断方法包括病原学诊断和血清学诊断。传统的病原学诊断方法是通过病毒的分离和培养来达到检测的目的，现主要通过反转录PCR(RT-PCR)或反转录－实时荧光定量PCR检测病毒核酸；血清学诊断方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒特异性IgM抗体，和空斑减少中和试验(PRNT)检测病毒特异性中和抗体。然后，以上方法分别存在着耗时长、检测过程繁琐、价格昂贵以及抗体检测存在的时效性和交叉反应较强等缺点，都无法实现简单、快速的寨卡病毒的检测模式。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法。

发明人前期构建了基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法(ZL.201310721893.4)。本发明在前期研究基础上，分别提出了基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，具有灵敏度高、简单快速、成本低等优点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，且该方法用于非诊断目的，其主要包括以下步骤：

(1)寨卡病毒核酸提取

①收集一定的组织或者细胞样本，组织及细胞样品需为感染寨卡病毒的样品，单次提取组织重量在0.1g以下为宜，细胞样品单个样品不能超过10⁷个细胞，避免样品数量过多导致细胞裂解无效；

②样本前处理：

a.组织样品

将组织在液氮中磨成粉末，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶，离心30分钟，除去上清；

b.单层贴壁细胞样品

除去培养板中的液体培养基，往培养板中加入胰酶，消化细胞1min，加入培养基终止消化，离心收集细胞并弃上清，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶；

c.悬浮培养细胞样品