[发明专利]基于电化学发光级联放大原理的端粒酶活性检测方法

说明书

本发明公开一种基于电化学发光级联放大原理的端粒酶活性检测方法，属于端粒酶活性检测技术领域。本发明利用端粒酶能执行添加重复序列的性能，结合电化学发光放大信号基团线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光方法，提出了基于电化学发光级联放大原理的高灵敏度端粒酶活性检测方法。本发明的方法具有如下优点：1)灵敏度高；2)探针稳定：线性及树状三联吡啶钌聚合物作为探针的电化学发光放大部分，性能稳定、聚合度及发光强度均一；3)检测过程简单、快速：经过简单的端粒酶提取过程即可进行端粒酶活性监测，耗时短，省去了扩增步骤，检测快速；4)成本低。

技术领域

本发明属于端粒酶活性检测技术领域，特别涉及一种基于电化学发光级联放大原理的端粒酶活性检测方法。

背景技术

端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，其以自身的RNA为模板，执行添加端粒重复序列TTAGGG至染色体末端的功能。近年来研究表明，端粒酶的活化可导致端粒长度的维持和染色体复制能力的增强，与人类衰老性疾病和肿瘤的发生发展有着密切的关系。因此，对端粒酶活性的检测可为癌症及衰老性疾病的诊断、预测以及临床治疗提供重要依据。传统的端粒酶活性检测方法(以聚合酶链式反应为基础的端粒重复序列扩增法)能够实现高通量、高灵敏度的检测。新兴的端粒酶活性检测方法(端粒重复序列扩增—银染法、聚合酶链式反应—酶免法、紫外吸收法、等温扩增法、电化学分析法、电化学发光检测法、荧光素—抗荧光素系统检测法等)可有效地测细胞质内端粒酶活性。然而，现有的端粒酶活性检测方法存在引物固定化、反应时间长、分析成本高、检测效率低、灵敏度低和操作复杂等问题。因此，开发新型的端粒酶活性检测方法，实现对端粒酶活性的简单、灵敏、低成本的检测模式是当前亟待发展的技术。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于线性及树状聚合物电化学发光放大方法的端粒酶活性检测方法。本发明采用分别采用线性及树状三联吡啶钌聚合物作为电化学发光放大信号基团，构建电化学发光探针，并将其运用于高灵敏度端粒酶活性检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的端粒酶活性检测方法，且该方法用于非诊断目的，其主要包括以下步骤：

(1)细胞及组织端粒酶提取

①用无DNA酶、RNA酶的1.5mL微量离心管收集25,000～100,000个细胞；

②将步骤①所得样品用台式离心机以3,000×g在室温(18～25℃)下离心5分钟，制备沉淀细胞，弃干净上清液；

③将步骤②所得细胞沉淀物重悬于冰冷的NP-40裂解缓冲液中，浓度为500～1,250细胞μL^-1，并在冰上孵育30分钟，得到全细胞裂解物；注意不要用RNA酶污染任何步骤。

④步骤③所得全细胞裂解物可以在液氮中快速冷冻并置于-80℃直到准备好进行分析；

⑤将步骤③所得全细胞裂解物使用台式微量离心机在4℃下以16,000×g 20分钟离心以除去细胞碎片。

⑥将步骤⑤所得样品放在冰上；用新鲜的无DNA酶/RNA酶的离心管收集80％的上清液，确保不会吸到细胞碎片；

⑦步骤⑥所得提取物可以在液氮中快速冷冻并置于-80℃直到准备进行分析。

(2)端粒酶序列延伸

①准备上述细胞及组织端粒酶提取中步骤⑥所得样品，使最终体积为2μL。将所有样品置于冰上。