[发明专利]基于电化学发光级联放大原理的端粒酶活性检测方法

权利要求书

1.一种基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的端粒酶活性检测方法，且该方法用于非诊断目的，其特征在于主要包括以下步骤：

（1）提取细胞及组织端粒酶

（2）端粒酶序列延伸

①准备步骤（1）提取的细胞及组织端粒酶样品，使最终体积为2 µL，将所有样品置于冰上；

②样品、引物、缓冲液的最终体积为每个样品50 µL；准备一个主混合物，包含每个样品100 ng TS引物：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'，每个样品100 ng ACX引物：5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'，1×dNTP混合物，20 µg. mL^-1 BSA，和足够的无RNA酶水使最终体积达到50 µL；

所述的TS引物的链端标记有生物素；

③向步骤①每个样品中加入48 µL步骤②所得主混合物；

④将步骤③所得样品在避光条件下22～30℃孵育30分钟，以通过端粒酶延伸底物；

⑤步骤④所得样品在95℃孵育5分钟以使端粒酶失活，终止延伸；

⑥收集步骤⑤所得产物，放于-20℃备用；

（3）电化学发光级联放大探针构建

电化学发光信号放大探针采用聚合度为10～100的线性、树状三联吡啶钌聚合物，并连接DNA识别域，其序列为5'-CCCTAACCCTAACCCTAACC-3'，多个DNA识别域分别与具有重复序列的端粒酶延伸链互补，从而在线性、树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大的基础上实现电化学发光信号的级联放大，其主要包含以下步骤：

①分别取10 μM的聚合度为10～100的线性、树状三联吡啶钌聚合物，加入等量的浓度为100 μM的DNA识别域，并在37℃环境下孵育过夜，完成信号放大基团与DNA识别域的连接；

②取50K道尔顿的超滤管，将步骤①所得的初产物移至超滤管，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；

③向步骤②中超滤管加入500 μL 1×PBS缓冲液，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；重复操作3次，将游离的DNA识别域离心至下层；

④用200 μL的超纯水溶解上层中的电化学发光信号放大探针，反复冲洗上层管底部，充分溶解探针；

⑤取步骤④所得产物置于-20℃，并经过冷冻干燥，得到固体产物，即电化学发光级联放大探针，并储存于-20冰箱备用；

（4）端粒酶活性检测

①取步骤（3）所得电化学发光级联放大探针，用超纯水溶解至1 μM，充分涡旋震荡溶解，如有不溶物，用适当用超声波处理；

②取步骤（2）中所得端粒酶延伸产物50 μL，加入5 μL 20×磷酸盐缓冲液及44μL超纯水，涡旋混匀；

③向步骤②所得体系加入步骤①所得电化学发光级联放大探针溶液1 μL，混匀后在37℃情况下孵育30分钟；使探针和端粒酶延伸重复序列充分杂交，构成电化学发光探针级联反应；

④向步骤③体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；

⑤将步骤④所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；

⑥将步骤⑤所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光仪器检测信号；

步骤（3）中所述的线性三联吡啶钌聚合物的合成过程，包括如下步骤：

（A）三联吡啶钌-赖氨酸单体合成

三联吡啶钌-聚赖氨酸单体的合成由羧基活化的三联吡啶钌和单一氨基保护的赖氨酸通过酰胺键形成稳定连接而实现；所述的羧基活化三联吡啶钌和单一氨基保护的聚赖氨酸的分子数比为1:1，反应条件为37℃过夜搅拌；

（B）固相合成起始

1）三联吡啶钌-赖氨酸单体硫醇化

①三联吡啶钌-赖氨酸单体羧基活化：

三联吡啶钌-赖氨酸和NHS保持一定的分子数比，在EDC存在的催化下，60℃搅拌孵育1h；所述的三联吡啶钌-赖氨酸单体与NHS的分子数比为1:10～1:100；

②羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇连接：

羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇间连接通过酰胺键的形成而实现；所述的羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇的分子数比为1:1；

2）线性三联吡啶钌聚合物链端的固定

线性三联吡啶钌链端的固定采用金-硫键连接，将硫醇化的三联吡啶钌-赖氨酸单体和金基质玻璃片连接，从而使后续的延伸、合成终止及纯化过程的清洗步骤得以简化；

（C）固相合成延伸

固相合成的延伸以线性三联吡啶钌聚合物的链端固定为起始，使三联吡啶钌-聚赖氨酸单体逐个添加并延长线性链；主要过程包括如下步骤：

1）氨基去保护

所采用的三联吡啶钌-聚赖氨酸单体的链端被Boc氨基保护，能够定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接；向金基质固相固定体系加入TFA溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗；

2）酰胺键链接

由步骤1）所得氨基去保护末端，与三联吡啶钌-聚赖氨酸单体通过酰胺键实现连接；三联吡啶钌-聚赖氨酸单体活化的羧基末端通过脱水缩合，最终实现酰胺键连接；完成上述步骤即增加一个单体，循环往复步骤1）和步骤2），即得到长链线性三联吡啶钌聚合物，通过控制循环次数即得到聚合度一致的产物；每循环n次即得到聚合度为n+1的线性三联吡啶钌聚合物产物；

（D）固相合成终止

根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使反应终止，需向反应体系中加入TFA溶液，使末端Boc脱落，从而提升其溶解性；并最终通过谷胱甘肽与金基质玻璃片作用，使线性三联吡啶钌聚合物脱落，最后收集液态产物；

（E）产品纯化

步骤（D）所得液态产物，通过超滤管离心过滤，聚合物产物将聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即得到较纯的反应产物；最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理，即得到干粉状的线性三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存；并根据实际需求称取溶解得到水溶液；

步骤（3）中所述的树状三联吡啶钌聚合物合成过程，包括如下步骤：

树状三联吡啶钌聚合物的合成通过改变赖氨酸单体Boc保护位点，将所有氨基基团都保护起来，再通过时序性的去保护，逐个添加单体；其主要包括以下步骤：

Ⅰ）赖氨酸单体氨基保护及羧基活化

取相同浓度的(Boc)₂O与赖氨酸单体以1:1体积比混匀，60℃加热10min即完成反应，后经过NHS活化羧基，使其和氨基乙硫醇连接，得到硫醇化的赖氨酸单体，为后续的金基质固定提供连接位点；

Ⅱ）树状三联吡啶钌聚合物链端的固定

树状三联吡啶钌聚合物的固定采用金-硫键连接，将硫醇化的赖氨酸单体和金基质玻璃片连接，从而使后续的延伸、合成终止及纯化过程的清洗步骤得以简化；

Ⅲ）树状三联吡啶钌聚合物延伸

树状三联吡啶钌聚合物的延伸通过氨基去保护至酰胺键形成及氨基去保护再到酰胺键形成的循环过程，每完成一个循环即增加一个赖氨酸单体；所采用的赖氨酸单体的链端被Boc氨基保护，能够定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接；通过控制循环次数即得到聚合度一致的产物；每循环n次即得到聚合度为n+1的树状的聚赖氨酸聚合物产物；向金基质固相固定体系加入TFA溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗；

Ⅳ）固相合成终止

根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使反应终止，需向反应体系中加入TFA溶液，使末端Boc脱落，从而提升其溶解性；并最终通过谷胱甘肽与金基质玻璃片作用，使树状的聚赖氨酸聚合物脱落，并最终收集液态产物；

Ⅴ）连接活化三联吡啶钌分子

将活化三联吡啶钌分子与树状聚赖氨酸聚合物按1:1000的分子数比混匀，在硼酸钠缓冲液中完成三联吡啶钌与树状聚赖氨酸聚合物间的连接，反应条件为37℃避光孵育12小时；

Ⅵ）产品纯化

步骤Ⅴ）所得液态产物，通过超滤管离心过滤，聚合物产物将聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即得到较纯的反应产物；最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理，即得到干粉状的树状三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存；并根据实际需求称取溶解得到水溶液；

所述的金基质玻璃片的制备过程，包括如下步骤：

1）正电荷载玻片清洗

①取干净的正电荷载玻片先用1 mL丙酮浸洗1～3分钟取出；

②用1 mL异丙醇冲洗，后浸入1 mL的异丙醇溶液中处理1～3分钟；

③取出载玻片并用1 mL甲醇清洗，后浸入1 mL的甲醇中处理1～3分钟；

2）Au³⁺吸附及晶体种子生成

①取3 mM的HAuCl₄溶液8 mL，将步骤1）清洗后的载玻片浸入溶液当中，往其中加192 μL的25%的NH₄OH溶液的同时，剧烈振荡溶液反应1 min，溶液呈棕黄色的浑浊状态；

②用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；

③将上述载玻片放入1 mM的NaBH₄溶液中浸泡5 min，载玻片基底表面变成紫黑色，将载玻片基底放入超纯水中浸洗；

3）纳米金岛生长

①用超纯水清洗干净的载玻片基底后，浸入1:1的HAuCl₄和NH₂OH溶液中，摇床上摇晃5min；

②静置10min完成纳米金岛生长步骤，洗净后置于超净台自然风干，避免空气颗粒污染，得到金基质玻璃片。

2.根据权利要求1所述的基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的端粒酶活性检测方法，其特征在于：

步骤（1）中提取细胞及组织端粒酶的过程，包括如下步骤：

①用无DNA酶/RNA酶的1.5 mL微量离心管收集25,000～100,000个细胞；

②将步骤①所得样品以3,000×g在室温下离心5分钟，制备沉淀细胞，弃干净上清液；

③将步骤②所得细胞沉淀物重悬于冰冷的NP-40裂解缓冲液中，浓度为500～1,250细胞. µL^-1，并在冰上孵育30分钟，得到全细胞裂解物；

④步骤③所得全细胞裂解物在液氮中快速冷冻并置于-80℃直到准备好进行分析；

⑤将步骤③所得全细胞裂解物在4℃下以16,000×g 20分钟离心以除去细胞碎片；

⑥将步骤⑤所得样品放在冰上；用新鲜的无DNA酶/RNA酶的离心管收集80%的上清液，确保不会吸到细胞碎片；

⑦步骤⑥所得提取物在液氮中快速冷冻并置于-80℃直到准备进行分析。