[发明专利]用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关引物对

权利要求书

1.一种用检测SNP标记位点的引物筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：

所述SNP标记位点位于序列SEQ ID No.1第501bp处，该位点存在A和G两个碱基形式，在苗种繁育前对长牡蛎亲贝进行该SNP标记位点基因型鉴定，不同基因型糖原含量的顺序为GGAGAA，通过筛选该位点GG基因型的长牡蛎亲贝，提高后代群体的糖原含量;

包括步骤如下：

（1）所述长牡蛎亲贝基因组DNA的提取，具体为提取长牡蛎亲贝基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/µL;

（2）取上述长牡蛎亲贝基因组DNA为模板，利用引物配制反应体系：

具体反应体系为：基因组DNA 1µL，通用PCR mix 5µL，上游引物F和下游引物R各0.2µL，灭菌双蒸水3.6µL；

所述上游引物F为：5’-TCCGAACTTGGAATCCTCTC-3’，

所述下游引物R为：5’-GCAAATGTTAAGGTGGCTCA-3’；

(3）PCR扩增的反应程序为：

（4）SnaPshot 模板制备： 在15µL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1小时，然后75℃保温15 min以灭活SAP和ExoI酶;

（5）SnaPshot PCR扩增及纯化：以PCR产物作为SnaPshot PCR的模板，SnaPshot PCR的特异引物序列为：

5’- TTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGTAAACCACACACGG-3’

产物纯化：在10µL上述SnaPshot PCR产物中加入1 U SAP，震荡混匀，37℃保温1 小时，75℃保温15 min以灭活酶，4℃保存24小时或-20℃长期保存;

（6）毛细管电泳

1）电泳样品制备：首先将SnaPshot 产物稀释 20 倍：

试剂范围为：10µL总体积中包含Hi-Di Formamid 9.25µL，GS-120LIZ 0.25µL，SnaPshot产物0.5µL;

95℃变性5 min，后迅速冰冷 4 min;

2）毛细管电泳：使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号;环境条件：实验室温度：18-25 ℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV,结果使用 GeneMapper V4.0 对实验结果进行分析,判断不同基因型。