[发明专利]均环肽Cyclo-(Cys)6

权利要求书

1.一种均环肽Cyclo-(Cys)₆的制备方法，其特征在于，包括：

步骤一、将树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸、N,N-二异丙基乙胺DIEA加入树脂中，再加入二甲基甲酰胺DMF使之溶解，室温下震荡反应30～60min；然后加入甲醇孵育20min；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上；去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；取样检测确保氨基酸已经连接在树脂上，且已裸露出不带保护的氨基；

步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸，同时加入缩合试剂，与树脂上氨基酸进行缩合，然后去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰；

步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来；用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段；用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂，完成环化反应；采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入裂解液，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；

步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20℃保存；

所述步骤三中，完成环化反应后，将物料加入密封容器中，密封，然后置于2.5MeV、40mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，辐照剂量率为50～100Gy.min^-1，辐照剂量为10～20kGy，搅拌速度为100～150r.min^-1；

所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂、4-甲苯氢胺树脂、Wang树脂中的任意一种，所述溶胀的条件为加二氯甲烷DCM浸泡，并震荡30min；其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基；

所述步骤一和步骤二中，取样检测的方法为：取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5％的茚三酮乙醇溶液、0.3％的抗坏血酸溶液、60％的苯酚溶液各一滴，同时加热至105～110℃并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基；

所述步骤二中，半胱氨酸之间的缩合，采用的试剂及反应条件为：加入缩合试剂三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量或N,N-二异丙基碳二亚胺三倍摩尔过量，反应30min，反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂；所述缩合试剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯中的任意一种；

所述步骤三中，将直链肽从树脂上切割下来时所选用切割液为：三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为1～2％，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1～2h；所述步骤三中，直链肽环化反应的条件为：加入环化试剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min；

其中，均环肽Cyclo-(Cys)₆的结构式为：

2.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-(Cys)₆的制备方法，其特征在于，所述步骤一和步骤二中，每次所加入的氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸的用量均三倍摩尔过量于树脂；所述步骤一和步骤二中，去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20％哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂。

3.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-(Cys)₆的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，裂解液为为体积比为94.5:1:2.5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和纯水组成的混合液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2～3h。