[发明专利]一种真核启动子及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种真核启动子及其制备方法和应用，该启动子包括14种具有不同转录活性的突变CMV启动子中的任意一种，由人野生型CMV启动子中的NF‑κB结合位点以不同的组合方式替换人工碱基序列获得。本发明制备得到一系列新的哺乳动物启动子，其中三种启动子(T1P2、T1和P2)具有比人野生型CMV更强的转录活性，这三种启动子高转录活性启动子在这些生物医学领域具有潜在的重要应用价值。此外，还产生了一系列具有各种转录活性的工程化哺乳动物启动子，可以用于灵活控制合成生物学中的基因表达输出量。本发明真核启动子的制备方法，作为一种新方法用于制造具有不同转录活性的启动子，简单方便，成功率高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种真核启动子及其制备方法和应用。

背景技术

外源基因在哺乳动物细胞中的表达对于转基因治疗试验、DNA疫苗以及药物产品的生产和细胞生物学的基础研究是必需的。哺乳动物表达系统中外源基因的表达水平主要与表达载体中启动子的转录强度相关。因此，真核细胞中外源基因的表达，具有恰当的启动子至关重要。这些启动子在医学、药物及生物医学的药品生产、基因治疗，以及生命科学基础研究中具有重要应用价值。真核启动子的研发在基因治疗和药品生产领域具有特别重要的价值。

三十年前，研究人员在人巨细胞病毒(CMV)的基因组DNA(gDNA)中鉴定了出了强转录增强子/启动子(以下称为启动子)，这个启动子序列位于重要的极早期(IE)基因的转录起始位点(TSS)的上游，是已知最强的启动子序列之一。

通常，CMV IE启动子和人延伸因子α(EF-1α)启动子是各种哺乳动物细胞系中转录活性最强的两个启动子。在一些研究中，小鼠巨细胞病毒IE启动子启动效率也许会更高一些。然而，在人细胞(例如293EBNA或CHO-K1-S细胞)中，带有内含子A的CMV启动子在瞬时和稳定转染中蛋白质表达水平都是最高的。有研究在CHO细胞中使用Lonza's GS系统(工业中用于哺乳动物基因表达的常用载体之一)表达单克隆抗体(mAb)来比较两种启动子的表达能力，结果显示，小鼠CMV启动子比人CMV启动子效率要低。研究人员已经确认人CMV启动子在很多细胞中具有高转录活性，而且该转录调控元件在转基因动物的组织表达中具有广泛的转录活性。在早期和最近的研究中，CMV启动子也已经被普遍用作各种基因表达载体的基础元件。

全长人CMV启动子含有多个转录因子结合位点(TFBSs)，其中许多顺式作用元件多次重复出现，包括多个NF-κB/rel、CREB/ATF、AP1、视黄酸受体(RAR)、SP-1、血清应答因子(SRF)和ELK-1的DNA结合位点。四个NF-κB结合位点与TSS的距离各不同。一些研究表明NF-κB/rel位点不仅负责调节人CMV-IE增强子的活性，而且控制启动子基本的转录活性。然而也有一些研究人员认为，四个NF-κB结合位点对于CMV启动子激活是可有可无的。但以上结论并不是绝对的，该研究中，CMV启动子顺式作用元件的研究是在全病毒基因组感染细胞的背景下进行的，而实际上，CMV启动子通常用作载体系统中的转录调节元件。一些研究通过TNFα和IE1对CMV启动子的刺激，得出以下结论，CMV启动子中NF-κB结合位点与TSS和基因序列的距离不同，其对转录活性的影响会有区别。位点4和2发挥最主要的作用，位点3发挥的作用次之，而序列中保守但远离TSS的位点1对启动子的调节没有影响。但也有研究表明位点2和3分别表现为主要作用位点和低影响力的位点。很难得出确定的结论，这些顺式作用元件中的哪一个负责启动子的活化或抑制。重要的是，这些研究表明，CMV启动子是通过各种功能的顺式作用元件之间的相互作用来调节整体的转录功能。这些顺式作用元件形成了跨越整个增强子的功能网络。