[发明专利]一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法

说明书

本发明公开了一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，该方法为将荧光标记的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值即可。本发明建立了DNA甲基化过程的无损检测方法，不涉及甲基化以外的任何反应，检测结果最接近待测物的真实状态；对特异位点的甲基化研究具有普适性；无需二次标记或二次反应的检测方法，具有操作步骤简化，分析时间短，测定成本低的特点。

技术领域

本发明涉及一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法。

背景技术

DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶（如DNMT3a）作用下，催化底物S-腺苷甲硫氨酸（SAM），转移一个甲基至胞嘧啶的C5位置，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC） 的过程。作为重要的表观遗传学修饰方式之一，DNA甲基化与基因遗传和胚胎发育密切相关，也是肿瘤等疾病的潜在标志物。DNA的甲基化修饰方式和程度与MTases的作用方式和活性密切相关。研究DNA甲基化机制和分析方法，对于深入理解表观遗传机制、细胞生长过程和重大疾病诊断具有重要意义。

DNA甲基化的分析方法分为基因组整体甲基化水平分析，特异位点甲基化分析，以及新甲基化位点寻找等，常规方法包括甲基化特异性PCR（MS-PCR）、甲基化敏感的单核苷酸引物扩增（MS-SNuPE）、重亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法（COBRA）、甲基化敏感性斑点分析（MS-DBA）、限制性标记基因组扫描（RLGS）、甲基化免疫沉淀（MIP）等。虽然这些方法已被广泛应用于临床和基础研究，但多数方法操作繁琐、耗时长、检测成本高或依赖复杂设备。更为重要的是，这些方法只能对DNA甲基化的存在与否进行检测，无法对DNA甲基化的生成过程进行有效分析。实现动态甲基化过程的在线检测，对于加深甲基化过程机制的理解，精确研究甲基化转移酶活性、酶抑制剂、酶序列偏好性等具有重要意义。当前，尚无在线检测动态DNA甲基化过程的有效方法。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本方法基于甲基转移酶在不同温度下的活性差异，结合特定的控温方式，建立一种快速、简便的DNA甲基化动态在线检测方法，同时，利用荧光定量PCR仪实现DNA甲基化动态过程的高通量检测。结果表明，在不同温度条件下，甲基转移酶可以对目标DNA进行“吸附-脱附”的循环作用，消除非特异性干扰，实现DNA甲基化过程的无损在线检测，样本测试值与标准测试值的吻合度为92.07%。

本发明的目的在于提供一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，包括以下步骤：将荧光标记的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值。

进一步的，步骤1）中，所述DNA双链的终浓度为300～800nM。

进一步的，步骤1）中，所述甲基转移酶浓度为100～200nM。

进一步的，步骤1）中，所述甲基转移酶底物的终浓度为100～200µM。

进一步的，荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。

进一步的，步骤1）中，所述缓冲液中含有45～55 mM NaCl，8～12 mM Tris-HCl ，8～12 mM MgCl₂ ，0.8～1.2mM DTT。

进一步的，所述甲基转移酶选自DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L、DNMT1中至少一种。