[发明专利]一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法

权利要求书

1.一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将荧光标记的含甲基化位点的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；

2)记录检测过程中的荧光值，荧光值包括两条荧光标记的DNA链杂交后发生荧光共振能量转移FRET的初始信号F₀和甲基转移酶脱离DNA双链的荧光共振能量转移FRET的信号F₁；记录每一次升温后的FRET信号强度变化，实现DNA甲基化过程的高通量在线检测；

所述荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述DNA双链的终浓度为300～800nM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述甲基转移酶浓度为100～200nM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述甲基转移酶底物的终浓度为100～200µM。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述缓冲液中含有45～55 mMNaCl，8～12 mM Tris-HCl ，8～12 mM MgCl₂ ，0.8～1.2mM DTT。

6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述甲基转移酶选自DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L、DNMT1中至少一种。

7.一种甲基化转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将荧光标记的含甲基化位点的DNA双链、待测甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；

2)记录检测过程中的荧光值，荧光值包括两条荧光标记的DNA链杂交后发生荧光共振能量转移FRET的初始信号F₀和甲基转移酶脱离DNA双链的荧光共振能量转移FRET的信号F₁；根据荧光值的变化情况判断甲基化转移酶活性；

所述荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。

8.一种甲基化转移酶序列偏好性的检测方法，包括：

1)将用荧光标记的含甲基化位点的待测DNA双链序列、待测甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；

2)记录检测过程中的荧光值，荧光值包括两条荧光标记的DNA链杂交后发生荧光共振能量转移FRET的初始信号F₀和甲基转移酶脱离DNA双链的荧光共振能量转移FRET的信号F₁；根据荧光值的变化情况，判断甲基化转移酶对不同DNA双链序列的偏好性；

所述荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。

9.一种甲基化转移酶抑制剂的筛选方法，包括：

1)将荧光标记的含甲基化位点的DNA双链、甲基转移酶、待测甲基转移酶抑制剂、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；

2)记录检测过程中的荧光值，荧光值包括两条荧光标记的DNA链杂交后发生荧光共振能量转移FRET的初始信号F₀和甲基转移酶脱离DNA双链的荧光共振能量转移FRET的信号F₁；根据荧光值的变化情况，判断待测甲基转移酶抑制剂是否对甲基化转移酶具有抑制作用；

所述荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。