[发明专利]一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料

说明书

本发明公开了一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料。该方法包括：1)提供DNA分子，该DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；2)将该DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养该重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从培养基中收集融合蛋白，得到融合蛋白‑免疫磁珠复合物；3)将该融合蛋白‑免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。本发明降低了检测的噪声背景并增加了灵敏性和准确性；增强了检测的应用性和重复性。

技术领域

本发明涉及生物领域中一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料。

背景技术

生物发光成像是目前在基础生物医学研究中非常受重视且广泛应用的一种技术。在体内或体外实验中，生物发光是化学能转化为可见光。该反应基于荧光素酶在氧的存在下，使荧光素底物发生生化转化，产生发射光。在过去的十年中，生物发光成像已成为非侵入性监测的生物学方法，例如用于基因表达、蛋白质-蛋白质相互作用、T细胞和干细胞转运、肿瘤发生和治疗应答等方面，并进一步用于药物研发所需的高通量筛选实验的数据读出。

分泌型Nanoluc(secNluc)(GenBank:AFI79293.1)是一个新设计的分泌荧光素酶，具有结构稳定，半衰期长的优点。其发光强度高，辉光型动力学表现优秀，因此将成为生物发光成像研究中最有价值的工具之一。这种工程化的荧光素酶是单体的，并且在活细胞内和培养基中，可以在几天的半衰期内保持较高的酶稳定性。它利用腔肠素或furimazine，一种腔肠素模拟为底物，产生辉光型发光。secNluc的发光信号更明亮，大约是已广泛应用于生物医学研究的萤火虫荧光素酶和海肾萤光素酶的150倍。这些优点使secNluc成为生物发光成像的一个吸引人的工具。目前secNluc已经被用来产生各种各样的转基因生物和细胞，用于体内和体外研究。

与细胞内荧光素酶相比，分泌型荧光素酶在许多应用中是有特殊优点，例如非侵入性的定量评估、实时监测和药物高通量筛选。因此，分泌型的secNluc在这些研究领域中将成为有力的研究工具。尽管secNluc具有稳定性高，半衰期长和信号发射强度高的特点，但是报告系统应用该酶时有一些制约。例如，如同其它分泌型荧光素酶一样，secNluc分泌导致不可避免的与一些干扰成分的交融，如血清和残留的实验试剂、细胞培养时所用的培养基或在生物样品，如血液或尿液中存在；信号强度在低密度的细胞实验检测中可能不够强大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何将分泌报告蛋白与周围的干扰因素分离开，降低检测中的信噪比，增加了检测的灵敏性和准确性，同时将分泌报告蛋白置于优化的反应体系，增强其辉光型动力学表现，并且实现对分泌报告蛋白的富集，增强了检测的灵敏度。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法。

本发明所提供的检测分泌型报告蛋白含量的方法，包括：

1)制备DNA分子，所述DNA分子表达由分泌型报告蛋白和标签蛋白连接而成的融合蛋白；

2)将所述DNA分子导入生物细胞，得到含有所述DNA分子的重组生物细胞，用培养基培养所述重组生物细胞，使所述融合蛋白表达，用结合针对所述标签蛋白的抗体的免疫磁珠从所述培养基中收集(富集)融合蛋白，得到融合蛋白-免疫磁珠复合物；

3)将所述融合蛋白-免疫磁珠复合物在含有所述分泌型报告蛋白的底物的液体中检测所述分泌型报告蛋白的信号，根据所述信号确定所述分泌型报告蛋白的含量。

上述方法中，所述DNA分子可为载体或表达盒。所述DNA分子可只表达由所述分泌型报告蛋白和所述标签蛋白连接而成的融合蛋白，还可表达其它蛋白质，如当所述DNA分子为表达载体时，还可表达筛选标记蛋白。