[发明专利]一种用于牦牛亲子鉴定和个体识别的基因分型检测试剂盒

说明书

本发明公开了用于牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统基因分型的复合PCR扩增系统和检测试剂盒，所述引物带有荧光标记，可以扩增牦牛14个STR标记位点，这些标记多态性高、标记间不连锁、片段大小适当；所述STR检测系统通过所述14对引物的扩增和电泳检测，获得14个STR位点的基因分型结果；根据STR的分型结果和牦牛各STR的基因频率对牦牛进行亲子鉴定和个体识别。本发明的方案通过综合分析STR基因座分型结果能有效的进行牦牛的亲子鉴定和个体识别，进而可提高牦牛育种工作中系谱的准确性，加快育种进程，具有良好的应用前景和经济价值。

技术领域

本发明涉及动物核酸体外检测技术领域，具体涉及用于牦牛亲子鉴定和个体识别的STR标记检测系统基因分型的复合PCR扩增系统和检测试剂盒。

背景技术

系谱信息在牦牛育种中起着重要的作用。错误的系谱会大大降低遗传评定的准确性，影响选种选配的效果，降低群体的遗传进展，给牦牛产业带来巨大经济损失。然而，在实际养殖生产中，系谱记录错误是难免的，它受多种因素影响，如配种记录、产犊记录、系谱录入及整理中的人为错误，尤其在饲养粗放的散养式放牧状态下，犊牛出生后很难确定其父亲，甚至母亲。

短串联重复序列(Short Tandem Repeat,STR)，是广泛存在于生物基因组中的一类具有高度多态性的遗传学标记。由于其具有片段小、易扩增、灵敏性好、准确度高、检测速度快、信息含量大，适宜于微量或降解样品检测，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增等特点，将STR复合扩增技术应用于动物的亲子鉴定和个体识别方面具有极大的优越性。

在普通牛上，将STR标记应用于亲子鉴定的报道较多，而尚未见应用STR标记技术对牦牛进行亲子鉴定的报道。关于牦牛STR标记的研究只限于群体结构和进化分析，并且所用的引物都直接取自文献报道中普通牛的引物序列，如徐公瑾(2004年)从FAO指定的30个普通牛的STR标记中选择出26个标记用于天祝白牦牛的聚类分析；李齐发(2004年)利用链亲和素磁珠亲和捕获的方法构建了牦牛基因组STR富集文库，并通过20个重复次数较多的STR标记对牦牛进行了分子进化分析；曾玉峰(2013年)利用15个STR位点标记信息对6个牦牛品种进行了遗传多样性和进化树分析；赵芳芳(2015年)通过对野牦牛部分基因组序列进行STR序列搜索，找到43409个STR位点，并且利用其中的77个STR位点对麦洼牦牛进行群体遗传分化特征分析。

虽然利用部分普通牛的STR标记引物可以对牦牛的相应位点进行扩增，但是毕竟牦牛与普通牛在基因序列上存在一定的差异，直接利用普通牛的引物往往达不到对牦牛STR位点检测的最佳效果。本发明选择多态性较高且不存在连锁关系的36个普通牛的STR位点，在牦牛基因组上找到相应的DNA序列，对文献中引物和牦牛基因组序列进行分析，选择可以直接应用于牦牛STR扩增的引物，其他STR位点则重新设计引物；另外，在牦牛基因组上找到4个新的STR位点，设计合适的引物；对以上40个引物进行合成，以牦牛基因组DNA为模板对所选的40个STR标记位点进行扩增，挑选到21个条带清晰、得率较高、特异性好的引物；对这21个引物进行荧光引物合成，对牦牛基因组DNA混合池进行扩增，挑选荧光信号强、好判型、杂合度高、多态信息含量丰富的14个STR位点。最终，确定普通牛BM2113和ILSTS008位点的引物可直接用于牦牛相应STR的扩增；针对11个STR位点(BM720、CSSM036、CSSME070、HAUT24、HEL6、ILSTS006、INRA037、SPS115、TGLA227、YAK07、YAK08)设计的新引物可用于牦牛STR检测；在牦牛的基因组上找到一个新的STR位点CH28AC，可用于牦牛该位点的检测。

对所设计的引物进行组合和扩增条件摸索。多重PCR的不同引物进行组合主要根据以下一些原则：尽可能避免各引物间的互补结构、发夹结构等一结和二级构象；要求退火温度尽可能接近；考虑不同引物的扩增片段长度和荧光标记颜色；每种引物在选定的退火温度梯度范围内作PCR反应时能得到有效扩增。最终，确定了本发明中的STR扩增引物和检测系统。

发明内容