[发明专利]一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物代谢工程技术领域，具体涉及一种提高地衣芽 胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌。

背景技术

莽草酸作为一种传统中药具有消炎、镇痛和抗血栓的作用，是许多抗癌药物 的中间体，也是合成预防和治疗禽流感药物神经氨酸酶抑制剂“达菲”的关键 原材料。莽草酸途径仅存在于植物和微生物中，是细菌代谢的支路途径，但其部 分产物是人体所必需的，例如L-苯丙氨酸是人体和动物不能靠自身合成的必需 氨基酸，所以其中间体及产物具有很好的应用前景。

据文献报道，利用细菌生产莽草酸的研究主要集中在E.coli。然而革兰氏 阴性菌产生的脂多糖具有毒性，因此生产的莽草酸需要进行工艺复杂的脱毒处 理。而本发明方法选择公认安全(GRAS)的革兰氏阳性菌株地衣芽胞菌B.lich eniformis WX-02作为莽草酸的生产菌株，该菌株具有生产莽草酸的潜力，并且 具有安全生产能力，能大大降低生产莽草酸的经济成本。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种显著提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方 法及工程菌，以地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02为对象。敲除了PEP 节点处的关键酶丙酮酸激酶的基因，构建pyk缺陷菌株。另一方面以积累莽草酸 为目的，在WX-02Δpyk中敲除莽草酸激酶编码基因aroK，切断莽草酸后续反应， 使中间产物莽草酸得到有效积累。再者，在WX-02ΔpykΔaroK基础上敲除6-磷 酸葡萄糖异构酶基因pgi，增加莽草酸的前体物E4P的含量。在此菌株基础上通 过过表达莽草酸-5-脱氢酶基因aroD解除莽草酸反馈抑制而积累莽草酸。

本发明第一方面提供了一种高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株，所述工程 菌是将地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因pyk、莽草 酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，构建 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株，再将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168的P43 启动子、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD 和淀粉酶基因amyL的终止子连接至表达载体得到重组质粒，再将重组质粒转化 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株得到高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi/pHY-aroD。

积累莽草酸代谢途径中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)， 过表达莽草酸途径基因，致使莽草酸合成的有效碳通量增加，同时，敲除掉丙酮 酸激酶基因pyk，莽草酸下游代谢的第一个基因是莽草酸激酶基因aroK，以及糖 酵解途径中的重要基因6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，过表达莽草酸脱氢酶基因 aroD，增加地衣芽胞杆菌中莽草酸的产量。

具体的，所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的丙酮酸激酶基因 pyk序列如SEQ ID NO：1所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02 的莽草酸激酶编码基因aroK序列如SEQ ID NO：2所示；所述地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)WX-02的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi序列如SEQ ID NO：3所示； 所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168的P43启动子序列如SEQ ID NO：4 所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的莽草酸脱氢酶基因aroD 序列如SEQ ID NO：5所示；所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的 淀粉酶基因amyL的终止子序列如SEQ ID NO：6所示。

所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02保存于中国典型培养物保藏 中心，保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M208065， 保藏日期为2008年4月28日。

优选的，所述表达载体为pHY300PLK。

本发明第二方面提供了上述高产莽草酸的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建方 法，步骤包括：

S1、将地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02敲除丙酮酸激酶基因pyk、 莽草酸激酶编码基因aroK，和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，构建 WX-02ΔpykΔaroKΔpgi菌株；