[发明专利]一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法。

背景技术

氯化烟碱类杀虫剂是20世纪80年代末发展起来的一类新型农药，这种农药具有广谱杀虫活性，能有效防治作物、蔬菜、果树上多种害虫，同时具有触杀和胃毒作用，并且作用机制独特，对目前的多抗性害虫显示了优良的防效，对哺乳动物毒性较低。氯化烟碱类杀虫剂除了具有直接的杀虫效果外，还影响害虫摄食、交尾、产卵、引起生育不良、产卵量减少等生理作用。因此，氯化烟碱类杀虫剂广泛应用于棉花、水稻、小麦、蔬菜及各种果树上害虫的防治，这也就导致了这类杀虫剂在农作物中的残留，许多国家对其在动植物食品中的残留均有所限制。

目前，应用于该类农药的分析方法主要有固相萃取-高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、固相萃取-毛细管电泳法、高效液相色谱法等，虽然这种方法可以实现氯化烟碱类杀虫剂的检测，但是所需仪器价格昂贵，样本前处理复杂，并且需要专业的操作人员，从而限制了此类方法的广泛应用。随着检测需求的提高，现场快速高通量检测方法成为了检测方法的趋势，酶联免疫方法不仅操作简单方便，不需要专业的操作人员，同时还可以进行现场快速高通量检测，从而可以满足现在的检测需求。酶联免疫方法的实现依赖高效的抗体，而免疫原的成功制备是获得高效抗体的前提。

发明内容

要解决的技术问题：目前的氯化烟碱类杀虫剂检测方法主要是基于仪器的检测方法，此类方法所需仪器价格昂贵，并且样品前处理复杂，检测周期长，并且需要专业的操作人员，从而限制了此类方法的普遍应用。

技术方案：本发明公开了一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法，其中氯化烟碱类杀虫剂为啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺，包括如下步骤：

（1）Ni-Al₂O₃催化剂的合成

在烧杯中加入200mL去离子水，置于加热反应器上加热至80℃，然后将浓度均为1M的100mL硝酸镍溶液和100mL碳酸钠溶液同时加入到烧杯中，在机械搅拌状态下反应1~2h，然后将溶液的pH调整到8.5，随后加入5g氧化铝粉，继续加热搅拌反应50min，将溶液抽滤并用水洗4次，然后将滤饼放入烘箱中120℃条件下过夜烘干，研磨过筛；再将研磨过筛的粉末置于管式还原器中500℃下煅烧3h，再通入氮气、氢气反应3h后关闭加热使其自然降温，将制得的固体催化剂密封保存。

（2）氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原的合成

称取20mg啶虫脒于100mL反应瓶中，加入5mL甲醇将其溶解，再加入5mg步骤（1）制备的催化剂，然后抽真空，通入氨气和氢气，使得体系的反应压力在0.5MPa，于室温下反应2~4h后，将反应液进行离心分离出上清液体，再在35℃条件下用旋转蒸发仪将溶剂旋干，旋干后的固体即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原。

（3）氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的合成

将步骤（2）制备的半抗原用1mL甲醇溶解，然后再加入5mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，在搅拌的状态下加入0.5~1mL稀释10倍的25%戊二醛溶液，室温搅拌反应20min，将其逐滴加入到10mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液溶解的50~100mg牛血清蛋白BSA中，室温反应3h后将反应液在PBS缓冲液中透析3次，透析后的溶液即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原。

（4）氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的鉴定

用10%的SDS-PAGE凝胶电泳和紫外吸收光谱对合成的完全人工抗原进行鉴定。

本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤（1）中反应体系的机械搅拌反应时间为1.5h。

本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤（2）中合成半抗原的反应时间为3h。

本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤（3）中戊二醛的添加量为0.7mL。

本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤（3）中BSA的添加量为80mg。

一种使用步骤（3）合成的人工完全抗原制备啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺四种氯化烟碱类杀虫剂抗体。

将合成的四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原免疫BALB/c雄性小鼠，经过四次免疫后得到四种氯化烟碱类杀虫剂的通用抗体。