[发明专利]一种复合酶制剂的生产工艺

权利要求书

1.一种复合酶制剂的生产工艺，其特征在于，所述的一种复合酶制剂的生产工艺采用无花果曲霉 A.ficuum NRRL3135和里氏木霉混合发酵，经分离纯化得到一种复合酶制剂，其具体步骤包括：

1）无花果曲霉孢子悬浮液制备：将无花果曲霉的菌种接种在固态PAD培养基上，32℃划线培养72～96小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为10⁷-10⁸个/ml，得到无花果曲霉孢子悬浮液；

里氏木霉孢子悬浮液制备：将里氏木霉菌种接种在固态PAD培养基上，28℃划线培养20～40小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为10⁷-10⁸个/ml，得到里氏木霉孢子悬浮液；

2）无花果曲霉发酵种子液制备：按8-10%的体积接种量将无花果曲霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，32℃，180rpm，pH 5-6,溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到一级种子；按8-10%的体积接种量将一级种子接种到二级种子罐内，32℃，180rpm，pH5-6,溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到无花果曲霉发酵种子液；

里氏木霉孢子发酵种子液制备：按5-8%的体积接种量将里氏木霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，28℃，150rpm，pH 5-6,溶氧20%-30%，培养20-24小时，得到里氏木霉发酵种子液；

3）发酵培养：以5-8%的体积接种量将无花果曲霉发酵种子液接种到装有发酵培养基的液体发酵罐内，于32℃、250-300rpm 转速下培养，在发酵开始5h后以8ml/L.h的流速补加含有12ml/LPTM₁的甘油，培养12-15h后下调温度至30℃，以10%的体积接种量补加里氏木霉发酵种子液，继续培养10-12h，停止流加甘油，当DO开始上升时，调节温度到28℃，同时以1ml/L.h的流速加入甲醇和氯化钙的混合溶液; 3h后每30min以增加10%的流速将甲醇和氯化钙的混合溶液的流速提升至2ml/L.h，发酵70-80h,得到复合酶制剂发酵液；发酵过程中溶氧保持30%-35%，pH保持5-6；

4）分离浓缩：将发酵液以4000r/min，离心15min，得粗酶液；在上清液中加硫酸铵至饱和度20％，再取上清，加硫酸铵至饱和度60％，取沉淀溶于pH为6.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ 缓冲液中，获得酶液，酶液依次通过孔径为0.6-0.8μm 的微滤膜微滤和孔径为0.005-0.015μm的超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；

5）向浓缩酶液中加入其质量的5-12％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体植酸酶；

其中：

步骤2）中所述的种子培养基成分如下：1-3％木糖渣，1-4％麸皮，1-5％葡萄糖，1-4％蛋白胨，0.2-0.5％硫酸铵，0.3-0.6％磷酸二氢钾，0.05-0.09％硫酸镁，其余为水，121℃、1×10⁵pa灭菌20min；

步骤3）中所述的发酵培养基成分如下：2-7％木糖渣，1-4％麸皮，0.2-1％微晶纤维素，0.5-0.8％豆饼粉，1-3%乳清粉、蛋白胨0.6-0.9％、0.2-0.5％硫酸铵，0.1-0.3％尿素，0.3-0.6％磷酸二氢钾，0.05-0.09％硫酸镁，0.3-0.6％吐温80，甜菜碱0.1-0.3%，其余为水，121℃、1×10⁵pa灭菌20min；

步骤5）中所述的稳定剂组成为：氯化钙0.1mol/L、氯化镁0.6mol/L、海藻糖0.2mol/L、蔗糖0.8 mol/L。

2.根据权利要求1所述的一种复合酶制剂的生产工艺，其特征在于：步骤1）中所述的PAD培养基成分如下：葡萄糖20g，马铃薯250g，琼脂20g，加水至1000ml，121℃、1×10⁵pa灭菌20min。