[发明专利]一种基于单引物探针捕获检测微生物目标序列的方法

说明书

一种基于单引物探针捕获检测微生物目标序列的方法，包括：将包含微生物目标序列的DNA样本片段化，然后进行末端修复；将末端修复后的DNA片段连接接头；使用单引物探针与靶序列的探针结合位点退火并延伸以进行靶序列捕获，其中探针结合位点位于靶序列的上游或下游，单引物探针包括探针序列部分和位于探针序列部分5’端的公共序列部分；使用一对通用PCR引物对捕获的靶序列进行扩增；对扩增产物进行测序分析。本发明的方法省去洗脱进行目的片段分离，简化操作步骤，减少目的片段不必要的损失，且杂交时间相对较短，适合快速检测需求；单引物探针即可进行捕获，减少前期探针设计的复杂度；扩增时采用公用引物去除不同引物富集产生的不均一性。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种基于单引物探针捕获检测微生物目标序列的方法。

背景技术

随着测序技术的发展，二代测序(NGS)检测方法在各个领域中的优势逐步凸显，与传统的研究方法相比其快速省时、结果精确，可以准确灵敏地检测物种DNA序列的优势被广泛应用于各个研究领域中。但由于目前全基因组测序(WGS)的周期相对较长，测序成本相对较高仍然限制了WGS的应用范围。而目标序列捕获技术的应用刚好解决了WGS测序时间长及成本高的问题，同过对特异的目标序列的捕获富集减少了测序结果中不需要的数据所占比例提高了目标序列检出比例使测序所需的数据量大大减少进而降低检测成本。尤其是对微生物的研究，不同样本类型的检测结果中都会含有不同程度的背景序列导致对测序数据量的要求较高，同是对目标微生物的检测结果分析也造成干扰。

通过捕获的方法对目标序列进行特异性检测技术包括：罗氏NimbleGen序列捕获技术，该技术通过固相或液相芯片对目的片段进行捕获，探针长度为50-105bp。主要流程包括，基因组片段化及末端修复、接头连接、杂交、芯片洗脱、目的片段洗脱、扩增和测序。安捷伦SureSelect DNA捕获阵列技术，该技术与NimbleGen技术类似，也是通过固相或液相芯片对目的片段进行捕获，探针长度为120bp左右。主要流程包括，基因组片段化及末端修复加A、接头连接、扩增、杂交、洗脱、扩增和测序。用于捕获测序的AmpliSeq On-Demand Panels技术，通过多重PCR将目的片段进行富集，再对富集后的片段进行建库、测序。

罗氏NimbleGen序列捕获技术和安捷伦SureSelect DNA捕获阵列技术的探针长度均较长，相较于短探针而言合成成本高。NimbleGen建库流程中杂交后需要两次洗脱步骤，增加了操作时间、复杂度与样本的不必要损失，同时洗脱试剂增加了建库成本。安捷伦技术杂交和洗脱时间均较长不适合快速检测需求，同时增加了一步扩增反应，也增加了建库操作时间。AmpliSeq技术利用多重PCR进行富集时由于不同引物的扩增效率存在差别，以及引物间的相互影响导致不同目的片段的富集结果不均一，不适合做定量分析。PCR扩增循环数多容易引入位点突变，影响结果判断。

发明内容

本发明提供一种基于单引物探针捕获检测微生物目标序列的方法，在建库流程中将接头连接在探针结合位点上游，使得后续扩增时只能对捕获到的片段进行富集，省去现有方法通过洗脱进行目的片段分离的步骤，简化操作步骤，减少目的片段不必要的损失，且杂交时间相对较短，适合快速检测需求；并且单引物探针即可进行捕获，减少前期探针设计的复杂度，而且探针长度较短合成成本较低；扩增时采用公用引物去除不同引物富集产生的不均一性。

本发明通过如下技术方案实现：

一种基于单引物探针捕获检测微生物目标序列的方法，包括：

将包含微生物目标序列的DNA样本片段化，然后进行末端修复；

将末端修复后的DNA片段连接接头；

使用单引物探针与靶序列的探针结合位点退火并延伸以进行靶序列捕获，其中上述探针结合位点位于上述靶序列的上游或下游，上述单引物探针包括探针序列部分和位于上述探针序列部分5’端的公共序列部分，其中上述探针序列部分用于与上述探针结合位点退火，上述公共序列部分用作通用PCR引物的结合位点；