[发明专利]一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法

说明书

本发明公开了一种利用转录组测序全面快速检测大蒜病毒的方法。此技术基于转录组测序的转录组技术，利用从头组装和蛋白比对等生物信息学分析方法，筛选大蒜病毒特异表达基因，设计大蒜病毒的荧光定量PCR引物，短时间内快速全面检测大蒜病毒。这个方法灵敏度高、特异性强、检测全面、速度快、总体成本低，可大规模应用于商业化大规模病毒检测、科学研究、病毒口岸和产地检疫。

技术领域

本发明涉及植物RNA病毒检测，具体涉及一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法。

背景技术

植物病毒有“植物癌症”之称，其繁殖速度快，传播方式多种多样，一旦大面积传播很难加以控制。某些植物病毒常常表现为复合侵染，并难以通过提纯病毒的方法将他们分离，因此传统的病毒检测方法通常难以达到理想的检测目的。大蒜(Allium sativum L.)，作为是百合科葱属最主要的植物之一，有着两千多年的栽培历史，是十分具有营养价值和药用价值的调味品、蔬菜和药材。生产中的大蒜花粉败育，主要以鳞茎进行无性繁殖，病毒一旦入侵大蒜植株，由鳞茎母体带病毒，常年无性繁殖垂直传染给后代，导致病毒逐代传递并积累，造成病毒病害逐年加重和大蒜种性退化，降低产量30％～80％，经济损失巨大，严重时甚至毁种。

大蒜主要受3个病毒属的12种病毒侵染，他们分别是马铃薯Y病毒属的洋葱黄矮病毒、韭葱黄条病毒、葱黄条病毒，香石竹潜隐病毒属的葱潜隐病毒、大蒜普通潜隐病毒、大蒜潜隐病毒，青葱X病毒属的大蒜A病毒、大蒜B病毒、大蒜C病毒、大蒜D病毒、大蒜E病毒和大蒜X病毒等侵染。它们均属于RNA病毒，目前未经选择的商品大蒜至少受以上两种病毒侵染，病毒之间常常表现为复合侵染，并难以通过提纯病毒的方法将他们分离。

现有技术中病毒检测的方法主要有四种，以大蒜为例来进行说明：第一，外观症状检测法。这个方法根据病毒侵染大蒜后在寄主植株上的外观症状进行识别，但是侵染大蒜的病毒种类多且往往是复合侵染，不同病毒在大蒜上表现相似的症状，造成田间症状复杂，有的甚至是不显示症状，不利于观察观察和判断，只能在病毒病害的田间做初步诊断。第二，指示植物鉴别法。这个方法利用病毒在一些模式植物上出现特征性症状，作为鉴别是否存在病毒侵染或某种病毒的依据。这种方法工作量大、检测时间长、灵敏度差，且病毒症状反应常受环境、土壤和气候条件的影响；有些病毒的寄主范围很窄，找不到合适的鉴别寄主；不同病毒在同种植物上常产生相同症状，同种病毒在植物的不同栽培品种上的症状也不尽一致；复合侵染及病毒卫星RNA会影响症状表现；还有一些病毒常会产生潜隐侵染现象，这些都在一定程度上制约了这种方法的应用。第三，电子显微镜法，这个方法利用电镜可以直观地观察病毒形态结构以及病毒侵染寄主后引起的细胞超微结构变化，可以较明确的显示超微结构水平的细胞病理变化。但这个方法对操作技术要求较高，电镜价格偏高，工作比较集中，同时处理的样本数量少。目前电镜分辨率,以观察到的病毒粒子大小只能判断到科或属，科属以下的分类则无法判定，不同球状病毒的形态大小比较相似,同样用电镜无法判定。此方法只能用于实验室少部分样本的检测，无法大量广泛应用。第四，分子生物学技术。分子生物学检测是以病毒核酸为基础的检测方法，目前，植物病毒检测与鉴定常用的分子生物学方法包括核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术、多聚酶链式反应技术、实时荧光定量PCR(qPCR)技术等。其中，双链RNA电泳技术需要一定的技术和知识才能进行准确诊断，且不适合大量样品和DNA病毒的检测。PCR的精确度有待提高，qPCR技术准确度较高，是目前较普遍的检测病毒的方法。但是，qPCR对引物的特异性要求高。针对大蒜各病毒，国内外有超过100对以上的大蒜病毒引物发表，但是对于不同地区或者大蒜品种没有普适性。大蒜在世界范围内分布广泛，所受侵染的病毒种类多，一对一对引物的的筛选和检测，浪费大量时间和金钱。此外，同属病毒之间同源性较高，特别是上面提到的侵染大蒜的青葱X病毒属病毒之间的同源性很高，这对qPCR引物的特异性要求很高。即使是同一病毒，其分布在不同区域，其基因序列也有差异。如2005年测定了侵染日本大蒜的3个韭葱黄条病毒病毒分离物基因组全序列，研究表明它们与中国韭葱黄条病毒分离物基因组全序列基因组序列不完全一致，他们之间的的同源性约为76％，编码蛋白氨基酸序列同源性约为81％。

发明内容