[发明专利]一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法

权利要求书

1.一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，具体方法如下：

1）选取侵染病毒的大蒜样品用Trizol法提取RNA，将RNA片段化并进行反转录、扩增、变性、环化形成单链环状DNA，并进行测序；提取的RNA需要满足以下全部条件RNA浓度≥250ng/μL，OD260/280=1.8～2.2, OD230/260≥2.0，RIN值≥6.5，28S:18S≥1.0；

2）过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的序列，对过滤后的序列进行组装，然后将组装的转录本进行聚类去冗余，得到特异基因（Unigene）；

3）利用Blastx将特异基因与大蒜病毒蛋白数据库进行比对，查找比对到大蒜病毒蛋白数据库的蛋白并做病毒种类注释，根据比对到基因代号，查找对应的核苷酸序列，利用Blastn在NCBI上进行比对，根据同源性找到特异基因对应的大蒜病毒种类进行进一步确认病毒种类：

4）根据注释病毒种类的特异基因设计特异的荧光定量PCR引物。

2.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，所述大蒜样品为茎尖、叶片、假茎、花序轴或根。

3.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，步骤2）中的低质量是指质量值低于20，即一条序列中某位置出错概率高于1%的序列；接头污染是指接头中污染的碱基数大于5bp；未知碱基N含量过高是指未知碱基N含量大于5%。

4.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，步骤4）根据注释病毒种类的特异基因设计特异的荧光定量PCR引物时，选择病毒中特异性最高的2~6个基因进行设计。

5.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，步骤4）引物设计时，引物的参数为：引物长度18~24bp，扩增片段长度75~200bp，Ta值58~62℃。