[发明专利]sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法

说明书

本发明公开了一种sn‑2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法。本发明的发明人在前期已从土壤中分离出了一株具有高产sn‑2选择性脂肪酶的黑曲霉菌株CCTCC NO.M 2012538。实验表明用其酶发酵液水解甘油三酯发现1,3‑DG/1,2‑DG的比值高于6，1,3‑DG的得率高于16.34％，而所产酶活力为8u/mL。本发明发现，不同的诱导剂、碳源、氮源以及不同的培养方法对产脂肪酶基因的表达会产生极大的影响，因此对培养基的优化和培养方法的选择极其重要。申请人筛选出一种适当的培养基及培养方法，并使酶活力从最初的8u/ml增加到20u/ml，为油脂改性，废水处理，婴儿食品开发奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法。

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3)，即三酰基甘油水解酶，不仅能够在油-水界面水解长链脂肪酸甘油酯生成游离脂肪酸，甘油二酯、甘油单酯和甘油，还能在非水相系统中发生酯合成反应、转酯化反应、酸解反应、醇解反应等，是一种重要的生物催化剂。此外它还具有位置专一性、结构专一性、光学异构专一性、和脂肪酸专一性，从而可对产物进行精确的控制。因此，目前已被广泛应用于油脂改造、食品加工、药物合成、生物能源开发、废水处理等现代工业领域。

脂肪酶最早发现于动物的胰腺当中，之后人们相继在植物、微生物中也发现的脂肪酶，其中以微生物产脂肪酶种类最多。目前已发现至少有100种产脂肪酶菌，约65个属，其中包括细菌28个属、真菌 23个属，酵母10个属、放线菌4个属。与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶稳定性更高，选择性强，底物特异性更广，具有广泛的pH 适用范围和强有机溶剂耐受性，是目前主要的工业脂肪酶来源。因此通过优化发酵条件来提高菌株产脂肪酶能力是一项极其重要的工作。

1,3-甘油二酯(1,3-DAG)是一种健康的油脂，它在体内消化酶的作用下直接生成甘油和游离的脂肪酸，然后直接转化为能量从而不在体内累积，因此减少了肥胖疾病产生的机率。但1,3-甘油二酯在天然油脂中含量比较少，因此开发一种制备1,3-甘油二酯的方法尤为重要，目前制备1,3-DAG是最为环保和可行的方法是生物酶法，而该法常用的一种酶是脂肪酶。用脂肪酶法制备1,3-DAG主要是酯合成、甘油解、转酯化法、甘油三酯水解四种，甘油三酯直接水解法又是其中最简单可行的方式，但这需要脂肪酶能专一性水解Sn-2位酯键才能实现，目前在国内外研究中关于具有Sn-2选择性的脂肪酶的报道极少。

发明内容

本发明的目的是：提供一种sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基及其使用方法，它能使得用微生物生产胞外脂肪酶能力得以提高。

本发明是这样实现的：sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基，按质量百分比计算，包括1.5-2.5％的芝麻油，0.8-1.2％的玉米，0.5-0.8％的牛肉膏，0.70-0.75％蛋白胨做复合氮源，0.03-0.05％MgSO₄7H₂O， 0.45-0.55％K₂HPO₄，0.18-0.22％(NH₄)SO₄，0.008-0.012％CaCl₂以及 0.45-0.55％NaCl₂，其余为水，pH为7.0～7.5。

按质量百分比计算，包括2％的芝麻油，1％的玉米面，0.6％的牛肉膏，0.72％蛋白胨，0.04％MgSO₄7H₂O，0.5％K₂HPO₄，0.2％(NH₄)SO₄， 0.01％CaCl₂及0.5％NaCl₂。

sn-2选择性胞外脂肪酶用培养基的使用方法，包括如下步骤：

1)将黑曲霉CCTCC NO.M2012538接种于种子培养基中，在28-32 ℃，150-200rpm下培养18-36h制得种子发酵液：