[发明专利]一种抗苹果坏死花叶病毒的抗血清及其制备方法

说明书

本发明公开了一种抗苹果坏死花叶病毒的抗血清及其制备方法。本发明所提供的制备抗苹果坏死花叶病毒的抗血清的方法包括如下步骤：以苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白作为免疫原免疫动物。本发明利用分子生物学手段通过在大肠杆菌中高效表达苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白基因，纯化出目的蛋白，以其免疫新西兰兔，制备得到了专一型的多克隆抗血清，本发明为该病毒的血清学检测以及苹果生产中该病害的防控提供理论基础。

技术领域

本发明属于植物病毒学和免疫学领域，涉及一种抗苹果坏死花叶病毒的抗血清及其制备方法。

背景技术

苹果是我国重要的经济作物之一，FAO数据显示，2014年，我国苹果栽培总面积约227万公顷，总产量约4100万吨，分别占世界苹果的50％左右，位居全球第一。我国苹果栽培主要分布于陕西、山东、河北、河南、甘肃、山西、辽宁、新疆等省，已成为带动地区发展的重要途径，并逐渐成为产业结构调整、经济发展的重要组成部分。但是，苹果病毒病在我国苹果产区的发生率较高，可达40-100％，一旦侵染，果树将终生带毒。其中，苹果花叶病是苹果生产中最常见的病毒性病害之一，严重制约着我国苹果产业的健康发展。

最近的一项研究表明，在苹果花叶样品中检测到一种新的病毒——苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)，ApNMV属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)第三亚组(Subgroup 3)，其基因组结构为三分体，包括RNA1、RNA2和RNA3，其中RNA3的5’端编码一个CP，由219aa组成，编码区长度为660nt。另外，该新病毒ApNMV在我国苹果花叶样品中的检出率高达82.6％，与花叶症状的发生存在较高的相关性，可能是导致我国苹果花叶病的重要病原物，对我国苹果栽培是一个严重的威胁。

病原检测是病毒病防控的前提与基础。目前，关于果树病毒的检测方法主要有生物学、血清学、电子显微镜观察和分子生物学方法。其中，生物学方法检测周期长、特异性差、工作量大，且对检测人员的田间实践经验要求较高；电镜观察虽然可以根据病毒和内含体特征及寄主细胞病变情况，较为直观地进行植物病毒的检测，但同分子生物学一样，该检测方法受到实验条件和检测设备的限制，对大量样品的检测相对繁琐。与之不同的是，血清学方法尤其是酶联免疫吸附分析方法(ELISA法)因其能够对大量样品进行快速、灵敏、准确的检测，以及实验成本低、方法简单等优点，成为植物病毒鉴定、分类以及检测的重要工具。但是，国内外尚无ApNMV血清制备及有效检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗苹果坏死花叶病毒的抗血清及其制备方法。

本发明提供的制备抗苹果坏死花叶病毒的抗血清的方法，包括如下步骤：以苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白作为免疫原免疫动物。

其中，所述苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；

(A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

在所述方法中，所述动物具体可为新西兰兔。

在所述方法中，免疫所述新西兰兔可按照如下进行：将所述苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(首次)或弗氏不完全佐剂(后续)进行乳化，使用SPF级新西兰兔进行皮内多点注射免疫，第一次免疫后休息一周，共免疫5-6次(如6次)，每次免疫所述苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白的用量为0.1mg。