[发明专利]一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物和方法

说明书

本发明公开了一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物和方法。所述引物包括外引物对Ho‑F3和Ho‑B3，以及内引物对Ho‑FIP和Ho‑BIP，序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，并以该引物建立了LAMP检测方法。本发明为水稻潜根线虫的快速检测鉴定和早期诊断提供了一个新的检测方法，特异性强、准确性高、灵敏度高，且操作简便、快速高效、简便易行、成本低、判定直观，实用性强、应用性广，结果稳定性强、可信度高，而且还可以直接检测混有不同种类的线虫样品中和植物组织样品中的水稻潜根线虫，无需样品分离，对进出境口岸和调运检疫以及田间病害早期诊断和监测工作中的水稻潜根线虫快速检测鉴定具有重要的意义。

技术领域

本发明属于植物病原分子检测鉴定技术领域。更具体地，涉及一种用LAMP引物和技术快速检测鉴定水稻潜根线虫的方法。

背景技术

水稻是主要的粮食作物，潜根属Hirschmanniella Luc Goodey, 1964下的很多种类是水稻根部线虫病害中最重要的病原线虫，在根系内迁移危害，其中分布最广、为害最大的种类是水稻潜根线虫H. oryzae (van Breda de Hann, 1902) Luc Goodey, 1963。因此，水稻潜根线虫的检测鉴定对于相关病害的防治具有重要的意义。

水稻潜根线虫的形态学鉴定主要根据头部特征，口针基部球形状，排泄孔位置，肠是否覆盖直肠，尾部形态，侧区的形态特征和虫体体环类型，以及雌虫的阴门和雄虫的抱片形态特征。这些特征需要用高倍显微镜才可以观察到，并且幼虫不适用于用形态学方法鉴定，单以雄虫的形态特征也不能鉴定到种。此外，潜根属的形态常受到环境和地理条件的影响，通过形态学特征已难以区分潜根属所有种类。因此，研究和使用分子生物学方法快速准确的检测鉴定水稻潜根线虫是非常有必要的。

目前对于潜根属线虫的分子序列信息研究尚少，GenBank数据库中仅仅保存了10个种的序列。有研究报道了水稻潜根线虫的PCR检测方法，设计了水稻潜根线虫的特异性引物，利用PCR技术对水稻潜根线虫进行分子鉴定，该方法虽然具有准确、灵敏的特性，但需要用精密而昂贵的RCR仪，检测过程复杂、时间较长，结果必须通过琼脂糖凝胶电泳检测才可以判定，不能满足口岸和调运等基层检疫以及田间监测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有水稻潜根线虫检测鉴定技术的缺陷和不足，为水稻潜根线虫快速检测鉴定提供一组LAMP引物和新的简便实用的检测方法，达到准确、灵敏、高效、简便和快速鉴定的目的。

本发明的目的是提供一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物。

本发明另一目的是提供一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物组，包括外引物对Ho-F3和Ho-B3，以及内引物对Ho-FIP和Ho-BIP，序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。

所述述LAMP引物组在检测鉴定水稻潜根线虫方面的应用，以及在制备水稻潜根线虫的检测鉴定试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP方法，以待测样本DNA为模板，利用上述LAMP引物组进行LAMP扩增。

优选地，所述LAMP扩增的反应体系为：10×Thermopol Buffer 2.5μL、引物25倍混合液2μL、10 mmol/L dNTPs 3.5μL、100 mmol/L MgSO₄ 1.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶 1μL、模板 DNA 1μL、ddH₂O 补足25μL；其中，引物25倍混合液包括40μM引物Ho-FIP、40μM引物Ho-BIP、5μM引物Ho-F3、5μM引物Ho-B3。