[发明专利]一种基于适配体DNAzyme对铅离子检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法。

背景技术

近几年，随着重金属对环境污染的日益加重，重金属污染已成为一个日益增长的生态学问题，并且也成为了一个全球关注的公众健康问题，而铅及其化合物是重金属污染中的一种重要的污染物。在汽车尾气、煤制品燃烧烟气、工业电镀、冶金废水、铅酸蓄电池等领域含有大量的铅，同时饮料、劣质食品、罐装食品等食物中也可能含有重金属，铅在水中无法降解，它对人体的神经系统、骨骼造血功能、消化系统、呼吸道系统等具有严重的损害，特别是大脑处于神经系统敏感期的儿童，对铅有特殊的敏感性。美国把普遍认为对儿童产生中毒的血铅含量下限由0.25μg/mL，下降到0.1μg/mL。世界卫生组织对水中铅的控制线已降到0.01μg/mL。我国食品重金属残留量限量国家标准规定铅含量最高（豆类）为0.8mg/kg，鲜乳为0.05mg/kg，生活饮用水国家标准限量为0.01mg/L。

目前检测Pb²⁺的方法主要包括紫外可见吸收光谱、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法（AFS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等，虽然这些方法能够达到精确灵敏的检测需求，然而这些方法所用的仪器价格昂贵，样本需要复杂的前处理过程，因此这些方法只适用于中心实验室使用。适配体是一种新兴的生物识别分子，是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选的一类能够识别目标分子的一段单链DNA或RNA分子，除了仅具有识别作用的适配体以外，还有一类能够同时具有识别和催化作用的功能性DNA分子，这类DNA分子称为DNAzyme，DNAzyme可以识别目标分子，并且能够催化特定的生化反应。Pb²⁺依赖的DNAzyme以Pb²⁺为辅酶因子，在Pb²⁺存在的条件下，DNAzyme链催化切割底物链，将底物链切割成两段，DNAzyme链从底物链上释放出来。

G四联体是一种特殊的核酸二级结构，它由具有连续G序列的DNA组成，G四联体和氯化血红素（hemin）结合后，可以显示出很强的过氧化物酶的活性，并催化H₂O₂作为氧化剂的一些反应，随着G四联体-hemin DNA酶的研究越来越受到人们的关注，在这一DNA酶的基础上，已经开发出了一系列高特异性、高灵敏的化学传感器。

发明内容

要解决的技术问题：由于检测Pb²⁺的仪器方法设备昂贵，样品需要专业的操作人员进行复杂的前处理流程，因此不适于大规模的普遍应用，限制了此类方法的使用范围。

技术方案：本发明公开了一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，包括如下步骤：

（1）生物素修饰的Pb²⁺的DNAzyme的底物链包被酶标板

首先将链霉亲和素用碳酸盐缓冲液溶解，再将其用碳酸盐缓冲液稀释成0.5~2.0ng/mL的包被浓度，以100μL/孔的包被量包被到96孔酶标板上，置于37℃烘箱中孵育2h，孵育完后将酶标板用含有0.5%Tween20的pH7.4的0.01M PBS洗涤液洗涤3次，最后拍干；生物素修饰的Pb²⁺的DNAzyme的底物链用pH7.4的0.01M PBS溶解，DNAzyme底物链的一端连接有G四联体DNA，再将其稀释成2.0~8.0ng/mL的浓度，加入到链霉亲和素包被好的酶标板中，每孔加100μL，将其置于37℃烘箱中孵育1h后，从烘箱中取出，用洗液洗涤3次拍干，即制得Pb²⁺的DNAzyme的底物链包被的酶标板。

底物链DNA：5’-ACTCACTAT(rA)GGAAGAGATGTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-3’。

（2）Pb²⁺的DNAzyme链与底物链杂交形成双链结构

Pb²⁺的DNAzyme用pH8.0的TE缓冲液溶解，将其稀释成2.0~8.0ng/mL的浓度，加入到步骤（1）包被好的酶标板中，每个孔的添加量为100μL，在37℃条件下反应2h后，用洗液洗涤3次拍干，以除去未杂交的DNAzyme分子，从而得到含有DNAzyme杂交双链结构的酶标板。