[发明专利]一种基于适配体DNAzyme对铅离子检测的方法

权利要求书

1.一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）生物素修饰的Pb²⁺的DNAzyme的底物链包被酶标板

首先将链霉亲和素用碳酸盐缓冲液溶解，再将其用碳酸盐缓冲液稀释成0.5~2.0ng/mL的包被浓度，以100μL/孔的包被量包被到96孔酶标板上，置于37℃烘箱中孵育2h，孵育完后将酶标板用含有0.5%Tween20的pH7.4的0.01M PBS洗涤液洗涤3次，最后拍干；生物素修饰的Pb²⁺的DNAzyme的底物链用pH7.4的0.01M PBS溶解，DNAzyme底物链的一端连接有G四联体DNA，再将其稀释成2.0~8.0ng/mL的浓度，加入到链霉亲和素包被好的酶标板中，每孔加100μL，将其置于37℃烘箱中孵育1h后，从烘箱中取出，用洗液洗涤3次拍干，即制得Pb²⁺的DNAzyme的底物链包被的酶标板；

底物链DNA：5’-ACTCACTAT(rA)GGAAGAGATGTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-3’；

（2）Pb²⁺的DNAzyme链与底物链杂交形成双链结构

Pb²⁺的DNAzyme用pH8.0的TE缓冲液溶解，将其稀释成2.0~8.0ng/mL的浓度，加入到步骤（1）包被好的酶标板中，每个孔的添加量为100μL，在37℃条件下反应2h后，用洗液洗涤3次拍干，以除去未杂交的DNAzyme分子，从而得到含有DNAzyme杂交双链结构的酶标板；

Pb²⁺的DNAzyme ：5’-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-3’；

（3）Pb²⁺的检测以及紫外吸收值的测定

将Pb²⁺用切割缓冲液稀释成不同的浓度，具体浓度为：0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL，再将稀释好的Pb²⁺加入到步骤（2）制备的酶标板中，每孔加入100μL，在50℃的条件下进行酶切反应5~20min；酶切反应完后，将酶标板用洗液洗涤3次，每孔加入浓度为0.5μM的hemin100μL，25℃条件下反应1h后，每孔加入TMB显色液50μL，在37℃显色15-30min后，再加入50μL终止液，最后用酶标仪测定480nm的紫外吸收值。

2.根据权利要求1所述的一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于所述的碳酸盐缓冲液为pH9.6的0.01M的碳酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于所述的链霉亲和素的包被浓度为1ng/mL。

4.根据权利要求1所述的一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于所述的DNAzyme底物链的包被浓度为4ng/mL。

5.根据权利要求1所述的一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于所述的Pb²⁺的DNAzyme的杂交浓度为4ng/mL。

6.根据权利要求1所述的一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于所述的切割缓冲液为pH7.2的0.01M的Tris-HCl缓冲液。

7.根据权利要求1所述的一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于所述的Pb²⁺的DNAzyme进行酶切反应的时间为10min。

8.根据权利要求1所述的一种基于适配体DNAzyme对Pb²⁺检测的方法，其特征在于所述的显色时间为20min。