[发明专利]一种细胞中内源性表达RNA聚合酶的核酸构建物

说明书

本发明提供了一种细胞中内源性表达RNA聚合酶的核酸构建物，具体地，发现了一种可大幅度增强蛋白质翻译效率的新型核酸构建物，本发明的核酸构建物由具有特定启动强度的启动子（如RNR2、ADH1、GAPDH、TEF1、PGK1、SED1等）和RNAP（如T7RNAP、T3RNAP、T4RNAP、T5RNAP等）蛋白的编码序列构成，在酵母体外蛋白质合成体系中应用本发明的核酸构建物，所合成的荧光素酶活性的相对光单位值（RLU）非常高，可达到与外源加入T7RNAP相同效果。可高达6.6×10supgt;7/supgt;。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，较佳地，涉及一种细胞中内源性表达 RNA 聚合酶的核酸构建物。

背景技术

RNA聚合酶是一种RNA聚合酶（RNA polymerase）：以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶，是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。

T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）是来源于T7噬菌体的一种RNA 聚合酶，识别23 nt的保守启动子序列（pT7）并提供较强的转录活性。T7 RNAP广泛应用于大肠杆菌（ Escherichia coli）等原核生物中外源基因的表达，在真核生物中也有成功应用的报。在酵母系统中，将T7 RNAP在酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）或者毕赤酵母（ Pichia pastoris）中表达时，均能实现靶基因的高效转录，虽然其转录产物并不能被有效翻译成蛋白质。目前，无论是大肠杆菌（DE3 质粒）还是酵母（2μ 质粒）中，T7 RNAP均是以外源质粒的方式存在于细胞中的，尚无直接重组至其基因组中稳定高效率表达T7 RNAP的细胞系统。

蛋白质体外合成系统是指在细菌、真菌、植物细胞或动物细胞的裂解体系中，加入mRNA或者DNA模板、RNA聚合酶及氨基酸和ATP等组分，完成外源蛋白的快速高效翻译。目前，经常实验的商业化体外蛋白表达系统包括大肠杆菌系统（ E.coli extract，ECE）、兔网织红细胞（Rabbit reticulocyte Lysate，RRL）、麦胚（Wheat germ extract, WGE）、昆虫（Insect cell extract, ICE）和人源系统。

克鲁维酵母（ Kluyveromyces）是一种子囊孢子酵母，其中的马克斯克鲁维酵母（ Kluyveromyces marxianus）和乳酸克鲁维酵母（ Kluyveromyces lactis）是工业上广泛使用的酵母。例如乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母。与其他酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点，如超强的分泌能力，良好的大规模发酵特性、食品安全的级别及同时具有蛋白翻译后修饰的能力等，其作为宿主系统表达药用蛋白也已显示出巨大的潜力。