[发明专利]一种定点突变的甘露聚糖酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种定点突变的甘露聚糖酶，特别是涉及来源于Armillariella tabescens的β-甘露聚糖酶MAN47的突变体。

背景技术

β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖上β-1,4-糖苷键、促使其水解生成小的寡甘露糖的酶的总称。根据酶作用底物特异性和作用特点，β-甘露聚糖酶可以分为外切β-甘露聚糖酶和内切β-甘露聚糖酶两种类型。其中，内切β-甘露聚糖酶是降解β-甘露聚糖的主要酶，它主要水解甘露聚糖和异甘露聚糖(半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖)中的β-1,4-D-甘露糖苷键。β-甘露聚糖酶对底物有严格的键专一性。

β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物(海洋动物)、发芽植物(如番茄、咖啡豆、瓜儿豆、魔芋、四棱豆等)的种子和微生物(包括细菌、真菌和放线菌)中都有所发现，其中微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源。β-甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料和石油等工业中有广泛的应用。考虑到动物摄食、营养和饲料加工等过程的特殊要求，饲用甘露聚糖酶需具备一定的特殊性：如：良好温度稳定性，能够经受高温制粒的加工后在常温下仍具有高酶活；广谱的pH稳定性，一般动物的消化道不同位置酸碱环境不同，pH值在2.5-6.8左右，因此饲用甘露聚糖酶需要在酸性的环境下稳定存在的同时还需要在酸性和中性的条件下维持较高活性。

由于甘露聚糖酶在农业、食品等领域的广泛应用需求，人们对甘露聚糖酶的研究日益活跃。目前主要集中在(1)甘露聚糖酶的制备生产方法，如专利：CN201110038699.7(一种利用天然枯草芽孢杆菌制备β-甘露聚糖酶的方法)、CN201210133095.5(一种快速生产高纯度低聚甘露聚糖的方法)、CN200610073160.4(β-甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌)、CN200510103125.8(一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用)、CN201010601999.7(一种生产β-甘露聚糖酶的菌株及生产工艺)；(2)筛选和克隆来自不同物种或者具有耐热或者耐酸的β-甘露聚糖酶，如专利：CN200810113343.3(一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用)、CN200710121923.2(β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞)、CN201010550927.4(一种新型β-甘露聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备)、CN201110086452.2(耐热β-甘露聚糖酶及其编码基因、重组菌和应用)、CN201210121370.1(一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用)、CN201110410517.4(β-1,4-内切甘露聚糖酶Tvi Man5A基因的克隆及重组酶的制备)、CN201110330274.3(一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及基因和应用)、CN201010621906.7(一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和应用)、CN201310190483.1(高温β-甘露聚糖酶编码基因及基因工程菌和应用)、CN201310190147.7(一种β-甘露聚糖酶、编码基因及其生产菌和应用)、CN201110262497.0(一种pH2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A及基因和应用)、CN01410234352.3(一种高温酸性β-甘露聚糖酶Man5DW1基因和应用)、CN200510085377.2(一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用)；(3)对碱性和中性β-甘露聚糖酶的基因克隆，如专利：CN201110058791.X(一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及基因和应用)、CN201310062872.6(一种耐高温碱性甘露聚糖酶Man5X27及基因和应用)、CN201410234434.8(一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和应用)。

然而，目前饲料添加剂用酶生产后都需要经过高温制粒，添加剂的使用都是通过添加在饲料中一起喂食动物，经胃到达肠道，在肠道中发挥酶的作用。在这个过程中，饲用酶会受到动物肠道消化酶不同程度的破坏，而降低了使用效率，因此，发现和制造能够耐高温、耐酸、具有对消化酶(如对胰蛋白酶)耐受性提高的β-甘露聚糖酶，对于β-甘露聚糖酶用作饲用酶的应用十分有价值。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种定点突变的甘露聚糖酶，它具有耐高温、较宽的pH稳定性、对胰蛋白酶耐受性提高等优点。