[发明专利]用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌株的筛选方法，特别是一种用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法。

背景技术

限制性内切酶是可以识别双链DNA序列特异序列并进行切割的核酸酶(Ch.8,eds.De Bruijin,et al., Chapman & Hall, New York,78-92.1998)，其发现促使DNA重组技术的诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。在细菌中，限制性内切酶及其相应的甲基转移酶构成限制-修饰系统，以保护微生物不受外来噬菌体的侵染或质粒。同一系统的限制性内切酶和甲基转移酶在DNA上有相同的识别序列，但作用不同，限制性内切酶切割非甲基化的识别序列，甲基转移酶在识别序列上的特异性修饰可防止限制性内切酶的切割。限制-修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控两者的表达，使自身DNA首先受到甲基化保护,保护完成后再表达限制酶，而入侵的异源DNA并没有受到保护因而被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割的特性，保护宿主DNA而降解未被甲基化的外源DNA(Geoffery G.W.,Nucleic Acids Res,2539-2564.1991)。

关于限制-修饰系统在原核细胞中表达的研究表明,系统的建立和维持是以甲基转移酶的保护作用为前提。基于DNA分子的结构组成和特性，自然界中主要存在三类DNA甲基转移酶，分别是C⁵胞嘧啶甲基酶、N⁴胞嘧啶甲基酶和N⁶腺嘌呤甲基酶。其中，N⁴胞嘧啶和N⁶腺嘌呤甲基酶属于氨基-甲基转移酶(Malone et al. J.Mol. Biol. 253:618-632.1995)。当一个有限制酶识别位点的DNA被甲基转移酶修饰后，这个DNA分子就会具有抵抗相应限制酶的酶切的特性。即通常情况下，如果DNA识别序列相同(或识别序列包含在内)并且甲基化酶修饰位点和方式也一致，那么这种经过甲基转移酶特异性甲基化修饰的DNA就具有可以抵抗相似识别序列的限制性内切酶切割的作用，从而保护宿主细胞的DNA免受破坏。例如EagI的识别序列是5’CGGCCG3’,包含在NotI的识别序列之中(5’GCGGCCGC3’)，而且其甲基化位点和修饰方式一致(C⁵胞嘧啶甲基酶)，因而可以通过在宿主菌内表达M. EagI来抵抗限制酶NotI对DNA的酶切。

自20世纪60年代末第一个限制性内切酶被发现之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得应用。关于限制性内切酶的研究,多年来着重于它们作为工具酶的实用价值,包括新酶的发现与筛选、高产工程菌株的构建、酶纯化技术与程序的优化改进等。其中FspI是一种应用较为广泛的限制性内切酶，可识别六个碱基的核酸序列(5’TGCGCA3’)，不仅可作为普通的限制性内切酶应用于分子克隆，在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力。但由于表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的FspI限制酶不仅价格高，而且也限制了它的广泛应用及深入研究。同时，以上提及的一系列问题也限制了其他很多应用广泛的限制性内切酶的深入研究。

限制性内切酶具有能够切割DNA的特性，一旦表达将切割宿主细胞DNA，造成宿主细胞的损伤甚至死亡。因此，必须对宿主细胞的DNA进行特异性的甲基化修饰后才能实现其重组表达。现有技术一的方案中，利用了FspI对应的天然特异性甲基转移酶M.FspI进行宿主DNA的保护。具体步骤包括：提取天然来源菌株 Fischerella species 染色体DNA并制备DNA文库；利用M.FspI保护DNA不被FspI切割的特性，从文库中筛选出M.FspI基因；将带有M.FspI基因的质粒转化进入表达宿主工程菌株中。在获得DNA受到甲基化保护的表达宿主工程菌株后，将FspI限制酶基因构建于表达载体，转化进入上述菌株，诱导FspI的重组表达。表达后的纯化步骤涉及镍基质的亲和层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、肝素琼脂糖亲和层和凝胶分子排阻等层析纯化过程。其缺点在于：对宿主细胞DNA的甲基化保护在通过繁琐的DNA文库构建和筛选后，所获得的甲基化保护菌株只能特异性保护DNA免于FspI限制酶的切割，少有能用于其他限制酶的表达，应用范围极为狭窄。

发明内容