[发明专利]用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法，其特征在于，

（1）甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株的建立

a、甲基转移酶M.HhaI基因的获取

甲基转移酶M.HhaI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库方法，从菌株Haemophilus haemolyticus的基因组中使用甲基转移酶M.HhaI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.HhaI的基因；

b、构建甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株

将M.HhaI基因序列以酶切-连接的方式插入低拷贝表达载体pACYC184质粒中，连接产物转化进入克隆菌株DH5α并涂布于氯霉素抗性平板进行培养；

c、甲基化保护菌株的筛选

对转化后菌株进行甲基化保护程度的筛选；

d、限制性内切酶FspI基因的获取

限制酶FspI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库的方法，从菌株Fischerella muscicola SAG 1427-1的基因组中使用限制酶FspI基因的特异性引物获得限制酶FspI的基因；

e、构建限制性内切酶FspI的重组表达菌株

使用乳糖操纵子表达系统，将FspI基因序列以酶切-连接的方式插入PET28b表达质粒中，连接产物转化进入DH5α表达菌株并涂布于卡纳霉素抗性平板进行培养；通过测序，确认重组质粒的构建成功后转化进入R.FspI特异性保护菌株[pACYC184-M.HhaI，ER2566]，构建限制酶FspI的重组表达菌株；

（2）限制酶FspI的重组表达

将测序正确的重组表达质粒pET28b-R.FspI转化感受态细胞[pACYC184-M.HhaI，ER2566]，涂布于含卡那霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选培养，获得限制酶FspI的重组表达菌株；该菌株经扩大培养后，以IPTG诱导，获得限制酶FspI的重组蛋白，并确认细菌蛋白粗提液具有限制酶FspI的活性。

2.根据权利要求1所述的一种用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法，其特征在于， 步骤（1）中，从菌株Haemophilus haemolyticus的基因组中使用甲基转移酶M.HhaI基因的特异性引物PCR扩增获得了甲基转移酶M.HhaI的基因；获得甲基转移酶M.HhaI基因的方法如下：

菌株Haemophilus haemolyticus平板培养菌落以去离子水重悬后，95˚C温育10 min，作为PCR模板；PCR扩增的引物序列基于甲基转移酶M.HhaI基因的上游引物5’-端序列及下游引物3’-端反向互补序列进行设计合成；

合成的引物序列如下所示:

正向引物： 5’-CATGCATATGATCGAGATCAAAGA-3’

NdeI

反向引物： 5’-CCGTACTAACTCGAGCATAAAGGC-3’

XhoI

这一对引物用于特异性扩增M.HhaI基因，同时引入NdeI与XhoI的酶切位点，方便后续酶切-连接以及筛选实验；PCR扩增反应使用了KOD高保真DNA聚合酶并按照标准PCR反应流程进行，获得了与理论值大小一致的M.HhaI基因片段序列1；上述PCR扩增产物通过酶切-连接的方式与pACYC184载体形成重组表达质粒。