[发明专利]甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用

说明书

本发明涉及甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用。所述构建方法，步骤如下：(1)提取博伊丁假丝酵母基因组DNA为模板；(2)以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，制得fdh基因片段；(3)将fdh基因片段用双酶切后连接到质粒pET28a(+)中，制得质粒pET28a(+)‑fdh；(4)将质粒pET28a(+)‑fdh转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到表达fdh的重组菌株BL21(DE3)‑fdh。本发明中所述的引物对是根据NCBI中所登录的多株博伊丁假丝酵母的fdh序列设计的兼并引物，可以以多数博伊丁假丝酵母菌株的基因组DNA为模板扩增出fdh基因，而不受基因序列中个别碱基差异的影响。

技术领域

本发明涉及甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

氧化还原酶催化底物的氧化或还原，在生物体利用有机物的过程中起着至关重要的作用。氧化还原反应伴随着电子的传递，生物体内绝大多数的氧化还原酶在反应时需要辅酶作为电子传递体。反应过程中，伴随着有机物的氧化，还原态的NADH会被氧化为其氧化态形式NAD+，当NADH被消耗殆尽，会导致反应的终止。生物体内有NAD+＝NADH的相互转化系统可以持续为氧化还原酶提供还原态NADH，当氧化还原酶细胞外应用时，应为其持续提供还原态辅酶NADH，而甲酸脱氢酶(Formate Dehydrogenase，FDH)是最成功的辅酶再生体系之一，已应用于工业生产中。

中国专利文献CN104561052A(申请号201410803992.1)公开了一种重组甲酸脱氢酶及其制备方法和应用。一种甲酸脱氢酶基因突变体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一种重组甲酸脱氢酶，选自(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；或是(2)由SEQID NO.2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有甲酸脱氢酶活性的由(1)衍生的蛋白质。一种用于生产重组甲酸脱氢酶的基因工程菌，并且通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组甲酸脱氢酶的工业化生产，将其用于辅酶NAD+和NADH再生循环体系，并用于相关原料药及医药中间体的生产。

中国专利文献CN104087522A(申请号201410306082.2)公开了一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia.Pastoris)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册编号为CGMCC NO：8924，保藏日期为2014年3月17日。本发明还公开了上述酵母工程菌的构建方法和应用。该发明的酵母工程菌经甲醇诱导后，测的粗酶活为27.9U/mL。

虽然上述工程菌均能够表达甲酸脱氢酶，但受限于菌株的生长及酶活的原因，无法满足市场的需求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用。

本发明技术方案如下：

甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法，步骤如下：

(1)提取博伊丁假丝酵母基因组DNA为模板；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，以兼并引物进行PCR扩增，兼并引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，兼并引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，制得fdh基因片段；

(3)将步骤(2)制得的fdh基因片段用内切酶XbaI和BamHI双酶切fdh基因和质粒pET28a(+)，再用连接酶连接，得到质粒pET28a(+)-fdh；

(4)将质粒pET28a(+)-fdh转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布筛选平板，37℃培养24h后进行克隆子鉴定，选取阳性菌株，得到表达fdh的重组菌株BL21(DE3)-fdh。