[发明专利]甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用

权利要求书

1.甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取博伊丁假丝酵母基因组DNA为模板；

所述博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO. 2.2378；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，以兼并引物进行PCR扩增，兼并引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，兼并引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，制得fdh基因片段；

（3）将步骤（2）制得的fdh基因片段用内切酶XbaI和BamHI双酶切fdh基因和质粒pET28a（+），再用连接酶连接，得到质粒pET28a(+)-fdh；

（4）将质粒pET28a(+)-fdh转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布筛选平板，37℃培养24h后进行克隆子鉴定，选取阳性菌株，得到表达fdh的重组菌株BL21(DE3)-fdh。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30 循环；72℃延伸7min。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增体系如下，总体系50μL：

dNTP 5μL，上游引物 1μL，下游引物 1μL；模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶 2.5U，Buffer5μL，加双蒸水至50μL。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）中，筛选平板组分如下，均为质量百分比：

1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母提取物，2％琼脂，100μg/mL 卡那霉素，余量为水。

5.权利要求1所述构建方法构建的甲酸脱氢酶工程菌株在多环芳烃降解过程中的应用。